昆虫热激蛋白90的研究进展

张珂 翁群芳 付昊昊

（华南农业大学 天然源农药与化学生物学教育部重点实验室，广州 510642）

昆虫热激蛋白90的研究进展

张珂 翁群芳 付昊昊

（华南农业大学 天然源农药与化学生物学教育部重点实验室，广州 510642）

热激蛋白90（Heat shock protein 90，Hsp90）是细胞内最为广泛的分子伴侣之一，间接调控细胞内多条与细胞增殖、分化、存活、滞育以及与凋亡相关的信号转导通路。近年来，对Hsp90家族成员在分子水平上的认识不断深入，Hsp90已成为细胞免疫、信号转导以及抗肿瘤研究的前沿课题。昆虫功能基因组的研究正在世界范围内掀起热潮，与昆虫滞育相关热激蛋白的研究也不断深入。对近年来国内外Hsp90的生物学特性、生物学功能及其在昆虫防治中的研究现状及前景进行综述，以期为害虫综合防治的研究提供参考信息。

热激蛋白90 分子伴侣 滞育 应用

热激蛋白（又称热休克蛋白）（Heat shock proteins，Hsps）是生物体遭受不利环境条件胁迫时迅速产生的一种抗逆蛋白，可帮助生物机体度过不利环境条件［1，2］。Hsp90在分子进化中高度保守，参与调控、维持细胞内多种蛋白的构象和功能，使细胞在胁迫环境下正常存活［3］。在真菌和动物中，Hsp90广泛介导胁迫信号的传递，参与类固醇激素受体、激酶和转录因子的折叠，并激活底物，起始胁迫信号的传递［4-7］。

热激蛋白（Hsps）是一类在进化过程中古老且高度保守的细胞内蛋白。1962年，Ritossa［8］将黄猩猩果蝇（Drosophila melanogaster）的培养温度提高，发现了热休克反应（Heat shock response，HSR）。然而，直到1974年Tissieres等［9］利用SDS-PAGE才分离到了这些因热休克反应而产生的一组新的蛋白质，并将这些蛋白质命名为热休克蛋白。Adems等［10］证实了一切生物细胞（包括原核细胞和真核细胞）受高温诱导时，都可以合成一类具有相似功能和生活学活性的蛋白质。除高温诱导外，许多损伤因素（如缺氧、重金属离子、病毒感染、DNA 损伤和自由基）刺激作用后，都可以导致细胞发生热休克反应，诱导热激蛋白的合成［11］。之后又相继在几种昆虫中发现热休克反应和热激蛋白。昆虫热激蛋白按功能和分子量分为3个家族：小Hsp家族（sHsps），分子量在20-30 kD之间；Hsp70家族，分子量约70 kD；Hsp90家族，分子量在90 kD左右［12］。自1982年美国冷泉港举行第一届Hsps国际会议后，国际上对Hsps的研究热潮逐渐兴起。紧跟国际研究热潮，国内对Hsps的研究始于20世纪80年代中期，主要集中对哺乳动物（包括人类）、高等植物和昆虫等Hsps进行研究［13，14］。其中对Hsp70的研究最普遍，而对昆虫的Hsp90报道很有限。

1 HSP90 家族及其结构特点

1.1 HSP90家族

热激蛋白90家族，分子量在90 kD左右，包括大肠杆菌胞浆中的HtpG，酵母浆中的Hsp83与Hsc83，果蝇浆中的Hsp83，以及哺乳类胞浆中的Hsp90与内质网中的Gp96等。Hsp90 家族的第一个成员是在果蝇中发现的，其分子量为83 kD，所以又称为Hsp83 家族。Hsp90 家族常见有Hsp90、Gp96 等，该家族基因序列高度保守，真菌、植物、脊椎动物以及昆虫等不同种属Hsp90 的同源性在61%-79%，可见Hsp90 基因的高度保守性。不同种属Hsp90 C端最后4个氨基酸均为Glu-G1u-Val-Asp。

Hsp90是热激蛋白中的重要成员，常见的有两种即Hsp90（存在于胞浆中）、Gp96（存在于内质网中）。Hsp90在正常状态下的机体内就存在，受到外界不利环境条件刺激时表达加强；而Gp96在葡萄糖充足时不表达，只有在机体大量消耗能量导致葡萄糖匮乏时才开始表达。Hsp90蛋白序列的保守性极高，其氨基酸序列由三部分构成，即N末端（25 kD），C末端（55 kD）和中间的铰链区。

在动物细胞质中的Hsp90有2种亚型，Hsp90α和Hsp90β。其中，Hsp90α易受热诱导，而Hsp90β易受有丝分裂诱导。在ATP 协助下，Hsp90α主要帮助受损蛋白的转运、折叠，防止聚集并恢复其正常构象；Hsp90β与类固醇激素利用有关［15］。Hsp90在原核生物中的功能与真核生物不同，但对原核生物的生长发育过程也是必要的［16］。

1.2 HSP90的结构特点

Hsp90二级结构由α-螺旋和β-折叠组成。对于细胞质蛋白来说，一般表现出内部疏水和外部亲水性的特点。Hsp90分子由3个基本结构域组成。N端为高度保守的 25 kD结构域，具有ATP结合位点，能催化水解ATP［17，18］。C端为分子量为12 kD的结构域［19］，具有保守的MEEVD基序［20］。中间结构域的分子量为40 kD，结构不保守，比较多变；中间结构域与靶标蛋白的结合有关，已证实的如AKt/KB、eNOS等［21，22］。而且，靶标蛋白的结合还能增强Hsp90的ATPase活性［23，24］。

Hsp90的分子特征是25 kD的N端具有一个靶蛋白的结合部位P和一个ATP功能域［17，18］，C末端是寡聚化结构域，以二聚体的形式存在，具有钙调蛋白结合位点和多种蛋白的结合位点，如类固醇受体、肌动蛋白等［25］。Hsp90的热激诱导表达与热激应答元件（HSE）和热激转录因子（HSF）密切相关。正常生理状态下，HSF 以无活性的单体形式散布于胞质和核质中，由Hsp90等多种HSP组成的复合物可能参与了维持HSF 的单体形式；热激时，异常蛋白增多，由于Hsp90对异常蛋白具有较高亲和力，因此 Hsp90 与异常蛋白的结合释放HSF单体，HSF单体组装成有活性的三聚体，并获得了与HSE的结合能力，继而激活 RNA 聚合酶II，启动Hsp90转录；热激解除后，细胞内游离的Hsp90增多，并与HSF相结合，使其脱离HSE，最终将 HSF 转变成无活性的单体，关闭Hsp90的表达［26］。因此，Hsp90 功能的丧失会造成细胞的多种生理缺陷。

另外，真核细胞HSP90的N端结构域和中间结构域之间有一段荷电区，由大约50个氨基酸残基组成［23］。荷电区对于Hsp90的功能主要是起到共价连接、协助N端结构域和中间结构域的作用，以维持Hsp90的ATP结合状态的构象。

2 HSP90的调控机理和作用模式

2.1 HSP90基因的转录和表达调控

在正常生理状态下，细胞蛋白的折叠并不需要Hsp90 的参与，胁迫条件下Hsp90可以促使损伤蛋白的修复。热激逆境会导致包括Hsp90在内的很多热激蛋白基因大量瞬时表达，这种表达受热激因子（Heat shock factor，HSF）的调控。在热激蛋白基因启动子上有热激元件（Heat shock element，HSE），为HSF结合位点。在正常状态下，HSF 以单体和Hsp90二聚体相结合；在胁迫环境下，热激蛋白与HSF分离去处理变形蛋白，激活的HSF结构发生变化，转化为三聚体形式紧密结合于HSE元件上，从而启动诱导热激蛋白基因的转录［25，27］。不仅热激能诱导HSF的表达，其他如氧化、重金属和病虫害等许多逆境都能激活HSF的转录，从而进一步调控热激蛋白的表达［28］。

到目前为止，已经知道40种左右蛋白的空间结构和突变受到Hsp90的直接或间接调控，这些蛋白都在细胞生理生化变化过程中起重要的调控作用。Hsp90与甾体激素类受体结合后，使该受体处于准备与激素结合的构象状态，直到与激素结合后，引发受体激活，同时Hsp90被受体释放出来，证明Hsp90在调节甾体激素类受体的构象中起了重要作用［29］。Hsp90还能与多种蛋白激酶如酪氨酸激酶II、酪氨酸激酶P60v-src、分裂原蛋白激酶、钙调素、端粒酶等信号分子结合，参与多种信号转导途径。

Hsp90 家族蛋白功能中的一个重要部分是参与了细胞骨架动力学，细胞形态和机动性的调控。Hsp90能与肌动蛋白和微管蛋白结合，并大量存在于折叠的膜上。Hsp90 以一种依赖ATP 的机制调控肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用。无细胞系统的试验表明，ATP能诱导Hsp90 从F-肌动蛋白上解离下来。此外，细胞中Hsp90 表达水平的升高能改变细胞形态和增加细胞的迁移能力。

2.2 HSP90分子伴侣系统的作用模式

Hsp90在体内与多于100种的信号转导相关蛋白相互作用，充当分子伴侣功能［30］。Hsp90与蛋白激酶和类固醇激素受体等信号传导蛋白相互作用并形成复合体［31］，使其具有生物活性。Hsp90是机体重要的分子伴侣之一，主要在两个方面不同于其他分子伴侣：（1）辅助接近空间构象成熟的底物蛋白质，不共价修饰“客户蛋白”，仅改变其构象；（2）客户蛋白比较特殊，主要是参与信号转导通路的蛋白，如激酶蛋白、膜受体和核内受体及转录因子等。Hsp90在HOP、P23、Cdc37等辅伴侣分子（cochaperone）参与下与“客户蛋白”结合，许多辅伴侣分子竞争性结合Hsp90的C末端。热激蛋白作为分子伴侣，可通过防止其他蛋白质变性，使其恢复原有的空间构象和生物活性而保护细胞，维持细胞正常的生理功能［32］。

在生物进化过程中，Hsp90 是一种高度保守的蛋白质，主要存在于细胞浆中，在无压力胁迫条件下约占胞浆蛋白的1%-2%，压力胁迫下其含量更高［33］。作为分子伴侣，Hsp90 主要参与蛋白质的折叠、蛋白质完整结构的维持及调控、细胞周期调控、信号转导等途径。参与细胞循环的Weel 络氨酸激酶通过与Hsp90相互作用后才能发挥活性，从而对细胞周期进行调节［34］。Polo是一种参与细胞分化的蛋白激酶，研究发现 Hsp 90活性受到抑制时会导致Polo激酶失去活性，细胞不能正常分化［35］。大部分蛋白质在合成之后，必须折叠成它们最后的形态和高级结构以发挥正常功能。热激蛋白Hsp90 是分子伴侣家族的重要一员，其中央区域通常为客户蛋白结合结构域［18，36］，在辅助细胞内蛋白折叠和组装过程中起重要作用。它在细胞中表达丰度很高，可以参与许多重要细胞代谢活动［37］。

3 昆虫HSP90的研究现状

热激蛋白是昆虫体内大量表达，昆虫生存的重要调节剂。Hsp90作为生物体在各种环境胁迫下诱导表达的热激蛋白除抵御外界不良逆境的作用外，热激蛋白Hsp90与类固醇激素受体及蛋白激酶等信号传导蛋白相互作用并形成复合体［31］，使其具有生物活性，即使是在无胁迫的条件下，Hsp90也是真核生物必不可少的［38］。因此，研究昆虫热激蛋白意义非常重大，有助于了解昆虫生长发育与各种影响因子的变化关系。

3.1 HSP90广泛参与昆虫生长发育过程

Hsp90是一种高度保守并普遍存在于原核以及真核生物细胞中的分子伴侣，是真核生物生长发育所必需。Hsp90能辅助蛋白的折叠、激活和成熟，并改变和维持参与信号转导的蛋白构象，在细胞的生长过程中起着重要的作用［3］。最近也有不少研究表明，昆虫的热激蛋白基因可能在昆虫的生长发育、滞育期间、种群密度等方面起着一定的作用。Huang等［39］研究热激蛋白对美洲斑潜蝇冷耐受力和生长发育方面的作用机理，结果表明小分子热激蛋白含量在蛹期最高，而大分子热激蛋白（包含Hsp90）表达量则随着生长发育而呈递增趋势。杨丽红等［40］研究发现柑橘全爪螨（Panonychus citri）Hsp90基因在卵、若螨和成螨阶段均大量表达，说明Hsp90基因与维持基本生命活动和生长发育相关。在对赤拟谷盗（Tribolium castaneum Herbst）的Hsp83研究中发现，卵巢中Hsp83只能在性成熟的雌虫中检测到，而刚羽化的雌虫却没有，不管它们是否受到热胁迫，并且通过RNAi技术抑制Hsp83的表达使得雌虫无法产出成熟的卵细胞。可见，Hsp83在赤拟谷盗雌虫的卵巢发育期间起着重要保护作用［41］。在棉铃虫滞育期间Hsp70表达量并没有上升，而 Hsp90 的表达量却逐渐减少［42］。在形态进化过程中，Hsp90起到“突变缓冲器”的作用［43］。通过对果蝇（Drosophila melanogaster）的研究发现 Hsp90对基因突变具有形态缓冲作用。虽然基因发生了突变，但是由于Hsp90能维持突变蛋白的正常功能，使这些突变蛋白能正常参与发育和形态发生过程中的信号传导，最终本该表现出的突变表型在外形上表现正常［44］。因此，在Hsp90的保护下，这种突变是中性的并且可以累积，并以随机漂移的方式发生改变。最后当累积的突变超过了由正常Hsp90的适宜量所决定的阈值，或者当环境胁迫引起的阈值水平下降时，将诱导中性突变转变为选择性突变。

Miska等［45］研究发现柔嫩艾美耳球虫（Eimeria）Hsp90的转录发生在虫体的所有阶段，柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞过程中，虫体在宿主细胞内定居和发育同时受到宿主细胞内环境的应激。Peroval等［46］发现柔嫩艾美耳球虫Hsp90在虫体入侵宿主细胞的过程中表达量增加，而使用特异性抗体和格尔德霉素（GA）抑制其Hsp90的功能之后，虫体入侵宿主细胞和其生长发育均受阻。同样，Echeverria等［47］研究发现利用格尔德霉素（GA）抑制刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）Hsp90的功能之后，弓形虫的速殖子和缓殖子之间的相互转变受到阻碍，表明弓形虫Hsp90对虫体入侵宿主细胞和虫体在宿主细胞内生长发育也起到重要作用。Hsp90能够结合肌动蛋白和肌球蛋白，大量存在于折叠的膜上，而肌动蛋白和肌球蛋白是昆虫肌肉发育过程中的关键因子，Hsp90以一种依赖ATP的机制调控肌动蛋白和肌球蛋白的相互作用。Hsp90表达水平的升高能改变细胞形态和增加细胞的迁移能力，对细胞的生长发育起调节作用。Hsp90调控着机体内40种左右细胞生理生化过程中的调控蛋白，在机体的生长发育过程中起着重要的作用。

3.2 HSP90与昆虫滞育

大量的研究已表明热休克蛋白与滞育密切相关［12，48，49］。Hsp90与生物的发育密切相关，可以调控果蝇的卵子发生［50］，参与果蝇的表型进化［44］，并在细胞转型中起调节作用［51］，Hsp90在果蝇的形态突变和绝育上起着生物缓冲器的作用［44，52］；果蝇在正常发育情况下Hsp90表达量维持在较低水平［53］，但经热激和其他环境刺激表达量明显升高［54］；甘蓝根结线虫（Meloidogyne artiellia）的二龄幼虫在受到热激时，Hsp90的转录水平明显提高［55］，滞育和非滞育条件下肉蝇（Sarcophaga peregrina）经高温和低温处理都能诱导Hsp90的高表达［56］，南美斑潜蝇（Liriomyza huidobrenisis）Hsp90亦可由温度诱导表达［57］。竹蠹螟（Omphisa fuscidentalis）Hsp90在滞育后期表达量明显减少，Hsp90可能与滞育维持相关联［58］。二化螟（Chilo suppressalis）在滞育期间Hsps 的表达模式与竹蠹螟相似，Hsp90在滞育幼虫表达高于非滞育幼虫，冷激处理非滞育幼虫可以诱导Hsp90上调，而滞育幼虫则未显示上调表达［59］。秀丽小杆线虫滞育期，Hsp90转录水平明显提高了10-15 倍，滞育期恢复2 h 后，Hsp90转录水平明显下降［60］。丽蝇蛹集金小蜂（Nasoniavitripennis）Hsp90基因的表达量随幼虫滞育的进程而下降［61］。棉铃虫（Helicoverpa armigera）滞育蛹中Hsp90表达量下降，在美洲棉铃虫（Helicoverpa zea）滞育蛹中Hsp90 表达量也下降［42，62］。麻蝇（Sarcophaga）在滞育期间Hsp90表达量下降，Hsp90 在滞育期间的表达可能与蜕皮激素的降解有关［56，63-65］。这些研究表明Hsp90与滞育是密切关联的，Hsp90可能作用于维持蛋白的结构或活化蜕皮激素［66，67］。

已有很多研究结果表明，热激蛋白在昆虫体内的表达，与滞育存在一定关系，滞育与Hsp90 的表达量有更密切的联系。Hsp90 在不同阶段及包括脑、胸部肌肉、肠和卵巢等不同组织的表达量不同，且各种组织中均有其独特的作用。Hsp90的差异表达可以有效地帮助人们更好地了解这些蛋白对昆虫滞育的调节功能［42］。研究昆虫Hsp90基因的性质与基因的表达量，有利于阐明昆虫滞育诱导机理，以及预测滞育发生的时间。在生物防治方面，可以利用热休克蛋白Hsp90的表达机理来调控昆虫（如寄生蜂等）的滞育时间与时长，以提高防效。

3.3 HSP90和昆虫的抗药性

杀虫药剂进入生物体内后除了与其主要作用靶标结合发挥其毒性外，还可引起机体其他组织的损伤。如Bagchi等［68］发现倍硫磷、氯丹和异狄氏剂等杀虫药剂处理大鼠可引起其脑部脂类的过氧化及DNA 单链断裂，这主要是药剂处理后导致机体内产生大量活性氧或氧自由基所致。而Hsp蛋白的过量表达则可通过短期内改变细胞的代谢活性，防止蛋白降解、抑制细胞膜中脂类的过氧化、维持ATP 水平或诱导过氧化物歧化酶表达等消除这些氧化压力，从而保护细胞免受伤害［69］。Feng等［70］发现阿维菌素处理朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus）可显著诱导阿维菌素抗性、耐热品系和敏感品系朱砂叶螨Hsp90的过量表达，推测Hsp90的表达可能与其对阿维菌素的抗性和对极端温度的忍耐有关。王利华等研究发现高温适应性的灰飞虱可以提高其对毒死蜱的抗性，同时Hsp90表达量明显增多。因为热激蛋白与昆虫的正常生长发育密切相关，推测高温适应性灰飞虱对毒死蜱的敏感性下降也可能与热激蛋白的变化有关［71］。王海鸿［72］的研究也表明热休克蛋白的表达与烟粉虱的抗性有一定的关系。

3.4 已开展HSP90研究的昆虫

热激蛋白可提高机体对不良环境的耐受性，保护机体或细胞在随后的致死性应激中不受或少受伤害，同时还具有保护、修复蛋白质，参与机体免疫、交叉保护等特性［73，74］。目前在昆虫中已开展热激蛋白相关研究的昆虫种类主要包括双翅目、鳞翅目、直翅目、蜚蠊目、膜翅目和鞘翅目等。迄今已经在很多昆虫体内克隆得到了Hsp90的cDNA序列，如B型烟粉（Bemisia tabaciB-biotype）、温室白粉虱（Aleurodes vaporariorum）、褐飞虱（Nilaparvata lugens）、二化螟（Chilo suppressalis）、玉米螟（Ostrinia nubilalis）、日本沼虾（Macrobrachium nipponense）、棉铃虫（Helicoverpa armigera）、豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、印度跳蚁（Harpegnathos saltator）、中红侧沟茧蜂（Microplitis mediator）、盘绒茧蜂（Cotesia vestalis）、意蜂（Apis mellifera）、蝶蛹金小蜂（Pteromalus puparum）、欧洲熊蜂（Bombus terrestris）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua Hiibner）、异色瓢虫（Leis axyridis）、果蝇（Drosophila melanogaster）、地中海实蝇（Ceratitis eapitata）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、绿蝇（lucilia）、美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae）、赤拟谷盗（Tribolium castaneum Herbst）、家蚕（Bombyx mori）、半目大蚕蛾（Antheraea yamamai）、沙蟋（Gryllus firmus）、柑橘全爪螨（Panonychus citri）。比较发现Hsp90在不同物种体内，基因长度相差不大，编码的氨基酸数量相差不超过10个，是一个相当保守的基因。

4 展望

昆虫在动物界中所占的数量多，分布广，并且具有高度的适应能力和防御机能。研究发现，热激蛋白参与昆虫的耐热反应，因此研究昆虫热激蛋白与耐热性之间的关系，有助于了解昆虫生长发育与温度之间的依赖性。并且，除温度外的其他许多因素（如紫外线照射、病原物入侵、重金属离子的破坏、杀虫剂等）均能引起热休克反应，如有报道说杀虫剂影响热激蛋白的表达［75-78］。因此，研究昆虫热激蛋白的产生、变化规律可以了解昆虫的生长发育与各影响因子的变化关系，对害虫的综合防治提供新思路。

昆虫在地球上的广泛分布及对各种环境极强的适应性，与昆虫体内的调节机制是分不开的。生物体在一些不利外界环境的刺激下产生热激蛋白，使机体少受损伤或者不受损伤，Hsp90是热激蛋白中的重要成员，开展Hsp90的研究有利于揭示昆虫对环境的调节和适应机制。目前，Hsp90在昆虫中的胁迫应答机理、分子伴侣的作用及其在提高昆虫抗逆过程中的功能尚不明确，极少见到Hsp90伴侣复合体生理学功能的报道。近几年发现，Hsp90具有抵御高温迫害以及遗传缓冲的作用，此发现拓宽了人们对Hsp90的认识并引起了研究者们的极大兴趣。但昆虫Hsp90潜在的重要作用尚未发现，特别是昆虫Hsp90系统的特性、定位于不同细胞器的Hsp90功能和作用机制，以及Hsp90在昆虫抗高温和非生物胁迫过程中的具体途径还有待于进一步研究。环境胁迫、昆虫抗性与Hsp90之间的相互作用及分子机制的解析，对深入了解昆虫抗逆分子机理和滞育防治害虫具有重要的理论和实践意义。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Progress on Heat Shock Protein 90 of Insects

Zhang Ke Weng Qunfang Fu Haohao
（Key Laboratory of Natural Pesticide and Chemical Biology，Ministry of Education，South China Agricultural University，Guangzhou 510642）

Heat shock protein 90（Hsp90）is one of the most extensive molecular chaperones in cells, indirect regulation of intracellular multiple and cell proliferation, differentiation, and survival, diapause, apoptosis and related signal transduction pathway. In recent years, awareness of Hsp90 family members at the molecular level, Hsp90 has become immune cells, signal transduction and anti-tumor research frontiers. Insects functional genome research is a worldwide craze, heat shock protein related to insect diapause research also unceasingly thorough. This article summarized the biological characteristics of Hsp90 at home and abroad in recent years, the biological function of Hsp90 and its control research present situation and prospect in insect, in order to provide references information for the research of integrated pest control.

Heat shock protein 90 Molecular chaperone Diapauses Application

2013-08-13

国际原子能机构资助项目（15630）

张珂，女，硕士研究生，研究方向：昆虫分子生物学；E-mail：zhangke2110@163.com

翁群芳，女，副教授，研究方向：天然源农药，农药残留与环境保护，昆虫生理毒理等；E-mail：wengweng@scau.edu.cn