根癌农杆菌介导的虎杖茎尖转化研究

柳忠玉赵树进

（1. 长江大学生命科学学院，荆州 434025；2. 广州军区广州总医院，广州 510010）

根癌农杆菌介导的虎杖茎尖转化研究

柳忠玉1赵树进2

（1. 长江大学生命科学学院，荆州 434025；2. 广州军区广州总医院，广州 510010）

为了建立根癌农杆菌介导的虎杖茎尖遗传转化体系，以虎杖的茎尖为转化受体，研究了携带白藜芦醇合酶基因（PcRS）的根癌农杆菌载体介导的虎杖遗传转化若干因素对转化效果的影响。结果显示，较适宜的转化系统为预培养2 d，农杆菌菌液（OD600值为0.6）侵染10 min，共培养3 d，在含8 mg/L 潮霉素的培养基上诱导不定芽。利用该体系从 300 块茎尖外植体中共转化获得 15株抗性再生植株，经 PCR 和 Southern 杂交检测，有 6 株虎杖的基因组中已整合进了目的基因。

虎杖 茎尖 根癌农杆菌 遗传转化

虎杖（Polygonum cuspidatumSieb. et Zucc.）是蓼科多年生草本植物，根或根茎入药。虎杖根中含有大量具有治疗效用的次级代谢物，如白藜芦醇、虎杖苷、蒽醌类等。其中白藜芦醇具有抗肿瘤、抗衰老、保护心血管系统等广泛的生物学功能［1-3］。虎杖已取代葡萄，成为最重要的白藜芦醇药源植物。

尽管虎杖具有重要的药用价值和经济价值，但其分子遗传和基因组的研究仍十分缺乏。最近，郝大程等［4］利用测序技术分析虎杖根转录组特性，识别出与白藜芦醇、蒽醌及其糖苷生物合成有关的基因，并且发现大量序列代表转座子（TEs）和单重复序列（SSRs），这些结果有望用于虎杖植株的遗传改良。在白藜芦醇的生物合成途径中，白藜芦醇合酶是一个关键限速酶，在植物中过量表达该基因可以提高白藜芦醇含量或增强植物抗逆性［5］。建立快速高效的虎杖遗传转化体系显得尤为迫切，但是当前关于虎杖遗传转化体系的研究仍未深入和系统。现有的研究表明，虎杖是含酚类物质较多的药用植物，其愈伤组织诱导率低并且基部易褐化，不利于进一步的生长及分化［6］。利用发根农杆菌诱导虎杖毛状根的产生，能提高毛状根中活性成分含量，但存在阳性毛状根生长缓慢，容易褐化等问题［7，8］。利用植物茎尖为转化受体，不必经过诱导愈伤及分化成苗阶段，转化后可以直接成苗，茎尖转化已成功用于单子叶或双子叶植物，如小麦、棉花、玉米、太子参和高粱等［9-13］，而以虎杖茎尖为受体进行遗传转化的研究尚未见报道。

本研究以虎杖茎尖为转化受体，研究不同因素对茎尖遗传转化的影响，以期为利用虎杖茎尖建立优良的转化受体系统奠定重要的技术基础和提供理论依据，并为今后虎杖基因的分子生物学研究和品种改良奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 虎杖植株由广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心提供。

1.1.2 载体和菌株 本研究所用植物过量表达载体pCAMBIA1380-35S-PcRS为笔者构建［14］，含有虎杖白藜芦醇合酶基因PcRS（Polygonum cuspidatum resveratrol synthase）和潮霉素磷酸转移酶基因。根癌农杆菌EHA105由华南农业大学植物基因组学与生物技术重点实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 培养基配方 诱导培养基：MS + 0.05 mg/L TDZ（Thidiazuron，苯基噻二唑基脲）+ 0.5 mg/L NAA（naphthlcetic acid，萘乙酸），pH5.8。共培养基：MS+ 0.05 mg/L TDZ + 0.5 mg/L NAA + 40 mg/L AS（Acetosyringone，乙酰丁香酮），pH5.5。筛选培养基：MS+ 0.05 mg/L TDZ + 0.5 mg/L NAA + 6 mg/L Hyg（hygromycin，潮霉素），pH5.8。增殖培养基：MS + 0.1 mg/L CPPU（N-（2-chloro-4-pyridyl）-N'-phenylurea，氯吡苯脲）+ 1.0 mg/L NAA + 6 mg/L Hyg，pH5.8。根诱导培养基：MS +1.0 mg/L NAA + 0.5% 活性炭，pH5.8。

1.2.2 虎杖无菌苗的获得与茎尖外植体制备 将虎杖嫩茎剪成长 5 cm左右的茎段，冲洗约1 h，移到超净工作台上，用 70%的乙醇消毒 30 s，1.5%次氯酸钠振荡洗涤 20 min，再用无菌水冲洗 4-5遍。然后切取带腋芽的茎段 1 cm左右，接种到诱导培养基上诱导芽的生长。将诱导形成的丛生芽分离成单个芽，继续培养成苗。取虎杖无菌试管苗放到解剖显微镜下，剥掉生长点附近包裹的叶片，当茎尖裸露出来后用接种针轻轻划伤顶端分生组织，然后把附带有茎尖的0.5 cm左右长的茎段切下来备用。

1.2.3 虎杖茎尖潮霉素敏感性试验 在诱导培养基中添加潮霉素，将潮霉素的浓度设为0、2、4、8、15 和 30 mg/L 共 6 个水平，每个处理接入 100个虎杖茎尖外植体，试验重复 3 次，培养 15 d，观察外植体的色泽变化、生长状态和存活情况。

1.2.4 转化条件的选择 分别在保持其他因素相同的条件下进行单因素试验，评价各因素对农杆菌侵染虎杖茎尖的影响效果，以确定最佳的侵染条件。将处理好的虎杖茎尖在诱导培养基上预培养 1-8 d。将农杆菌悬浮液OD600值调整为 0.2-0.8，侵染经过预培养的茎尖受体5-25 min。侵染结束后用灭菌滤纸吸干多余菌液，置于垫有一张灭菌滤纸的共培养基上，黑暗中共培养 2-5 d。共培养结束后，转移到筛选培养基上，将筛选获得的抗性芽转移到增殖培养基生长至 3-5 cm高，再转至根诱导培养基使其长成完整植株。侵染后受体在光照培养箱中培养，光/暗为 16 h/8 h，温度 22-25℃。所有试验均为每个处理检测 100 个茎尖，重复 3次。采用潮霉素抗性芽的分化率（%）和增殖系数作为评价转化效果的指标，其计算方法如下：

分化率（%）= 再生抗性芽的茎尖数/ 接种茎尖数×100%

增殖系数= 茎尖再生抗性芽总数/ 再生抗性芽的茎尖数

1.2.5 转基因虎杖的PCR检测 用CTAB法提取转基因虎杖和野生型虎杖的叶片基因组DNA。用潮霉素基因特异引物HPTf（5'-CGCCGATGGTTTCTACAA-3'）和HPTr（5'-GGCGTCGGTTTCCACTAT-3'）进行PCR检测。PCR扩增条件为：94℃ 预变性 2 min；94℃变性 30 s，58℃退火 30 s，72℃ 延伸 30 s，共28个循环；最后 72℃ 延伸 10 min。预期扩增片段大小为500 bp。

1.2.6 转基因植株的Southern杂交 对PCR鉴定为阳性的转化植株和野生植株，取 30 μg虎杖基因组DNA，经EcoR I 酶切DNA，以引物HPTf和HPTr扩增的潮霉素基因为探针模板，用地高辛随机引物标记试剂盒进行标记。按照文献［14］方法进行Southern杂交。

2 结果

2.1 虎杖茎尖对潮霉素的敏感性

本研究以潮霉素作为筛选标记，为有效筛选抗性苗，将制备的茎尖分别置于不同浓度梯度的潮霉素培养基上进行筛选，观察外植体的色泽变化、生长状态和存活情况，试验结果见表1和图1。从表1和图1结果可以看出，对照组的虎杖茎尖生长迅速，并分化出绿色的芽，芽的存活率为 95.6 %；随着潮霉素浓度的增高外植体生长减缓，分化出的芽弱小且存活率逐渐降低至 23.7%；高浓度潮霉素处理造成植物组织失绿褐化并迅速死亡。当潮霉素浓度在4 mg/L 以下不能有效抑制非转化细胞的生长，容易造成大量非转化体的逃逸；潮霉素浓度在 15 mg/L以上时，外植体迅速死亡将影响转化细胞的正常生长；而潮霉素浓度 8 mg/L 处理既能有效抑制非转化组织的生长，又不至于造成细胞迅速死亡，所以潮霉素浓度 8 mg/L是茎尖转化外植体筛选的适宜浓度。

2.2 预培养时间对转化的影响

将虎杖茎尖分别预培养 1、2、4 和 8 d，侵染菌液浓度OD600值约 0.4，侵染茎尖 10 min，共培养 3 d，统计转化后获得的抗性芽百分率及增殖系数见表2。结果表明，适当的预培养可以提高茎尖的再生分化率。预培养 1 d 时的再生分化率较低（2.3%），再生芽生长细弱，不利于潮霉素抗性苗的获得；预培养 2 d 的茎尖再生分化率最高（4.7 %），再生芽生长健壮；预培养 8 d 时的再生分化率反而下降（2.4 %）。所以选择 2 d 作为预培养的时间。

2.3 菌液浓度对虎杖遗传转化的影响

将农杆菌的浓度OD600稀释为 0.2、0.4、0.6 和0.8，侵染预培养 2 d 的茎尖 10 min，共培养 3 d，以转化后获得的抗性芽百分率及增殖系数作为评价指标（表3）。本研究中不同的菌液侵染浓度对侵染效果的影响显著。菌液侵染浓度OD600在 0.2 时分化率只有2.4 %，浓度为 0.6 时的分化率达 5.5 %，之后随着浓度的增高分化率降低。故将农杆菌菌液浓度稀释至 0.6 进行侵染。

2.4 侵染时间对虎杖遗传转化的影响

分别侵染预培养 2 d 的茎尖 5、10、15、20 和25 min，菌液浓度OD600约 0.6，共培养3 d，以转化后获得的抗性芽百分率及增殖系数作为评价指标（表4）。经 10 min 侵染后的分化率与其他侵染处理都有显著差异，侵染5、20 和25 min 之间的差异不显著。侵染 10 min的再生分化率达5.3%，增殖系数较高且再生芽强壮，故将侵染时间选择在10 min。

2.5 共培养时间对虎杖遗传转化的影响

用OD600值约 0.6 的菌液侵染预培养 2 d 的茎尖10 min，分别于黑暗中共培养 2、3、4 和 5 d，以转化后获得的抗性芽百分率及增殖系数作为评价指标（表5）。不同共培养时间对侵染结果的影响差异较大，2 d时分化率较低（2.4 %），经3 d 共培养后分化率可达 5.6%，但是共培养 5 d 后的分化率又降到2.9 %。本试验条件下选择在侵染后共培养3 d 较为适宜，有利于获得较多生长健壮的抗性再生芽。

2.6 虎杖转化苗的获得

虎杖茎尖遗传转化各阶段如图 2所示。剥离好的茎尖经预培养后（图 2-A），进行农杆菌侵染，并共培养3 d（图 2-B）；然后转移到筛选培养基上筛选（图 2-C），不具潮霉素抗性的茎尖逐渐褐化死亡；将经筛选后成活的茎尖转移到增殖培养基上（图2-D），促进芽增殖与伸长；待幼苗生长至 3-5 cm高，转至根诱导培养基进行生根（图 2-E）；最后移栽到盆土中生长（图 2-F）。

2.7 转基因虎杖的PCR检测

按照上述遗传转化体系，剥取虎杖茎尖 300个，经农杆菌侵染转化、筛选，获得了移栽成活的抗性植株共 15株，潮霉素基因的PCR检测（图3）显示其中 6株为转基因的阳性植株，这些转基因植株均含有预期的约 500 bp的DNA片段。

2.8 转基因虎杖的Southern杂交

选取PCR鉴定为阳性的转基因虎杖植株，提取叶片基因组DNA，经EcoR I酶切、电泳、转膜后以潮霉素基因为杂交探针的Southern杂交结果（图4）表明，在这 6个株系中均检测到杂交条带，而野生虎杖没有杂交信号。因此，这些转基因虎杖株系的基因组中确实整合了目的基因。

3 讨论

本试验前期采用叶盘法和愈伤组织侵染方法进行转化遇到诸多困难：叶盘经过不同激素组合诱导，较难诱导产生不定芽；虎杖是含酚类物质较高的药用植物，其愈伤组织易褐化、难分化成苗。而植物茎尖具有变异性小、有利于保持原有材料的优良性状等特点，国内外很多学者利用茎尖或茎尖分生组织获得了转基因植株［9-13］。因此，本试验选择茎尖为转化受体，探讨了影响虎杖茎尖遗传转化的主要因素。

潮霉素的毒性机理是干扰植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体与延长因子EF-2 的结合，从而抑制肽链的延长。潮霉素浓度过低易造成假阳性率过高；潮霉素浓度过高，可能导致不能得到足量的转基因植株。在对植物材料进行基因转化之前，对受体材料进行潮霉素敏感性试验是十分必要的。段晓昱等［15］的研究表明向日葵茎尖、子叶、胚轴不同部位转化外植体对潮霉素敏感性存在一定的差异；大豆品种黑农 35的子叶节分化的潮霉素筛选浓度为 6 mg/L，而丛生芽生根的潮霉素筛选浓度降低为2 mg/L［16］；可见对于同一种植物，不同的外植体对抗生素的敏感性也是不同的。本研究通过虎杖茎尖对潮霉素的敏感性试验，确定了虎杖茎尖转化的适宜浓度为 8 mg/L。在连续筛选过程中一直使用同一浓度进行筛选，这可能是造成转化率低的原因之一。在后续的研究中可以考察虎杖不同部位外植体对潮霉素的敏感性，采用梯度添加筛选剂的方式来提高转化率。

在植物遗传转化中，预培养可以促进细胞分裂，处于分裂状态的细胞更易整合外源DNA，从而提高转化率；另一方面预培养能减少褐化现象的产生［17］。赵福永［18］对含酚类物质较高的棉花进行了预培养处理，根诱导阶段根诱导率要比对照组高 15%左右。虎杖也是含酚类物质较高的植物，本试验中预培养2 d 是最佳处理，而预培养时间超过 8 d，转化率显著下降。转化率随着预培养时间的延长先增加后下降，在高粱茎尖转化中也有类似报道，其原因可能是预培养时间过短茎尖伤口未愈合易受农杆菌的侵害；预培养时间过长茎尖伤口细胞已不能提供足够的诱导农杆菌贴壁的受体，或由于茎尖分生组织细胞的分裂速度减缓，进入细胞核的T-DNA 量减少［13］。王沛雅等［19］对河北杨的遗传转化研究表明，预培养2 d以上可以显著提高转化率，但预培养 2-8 d 间的差异不显著，转化率并不表现出随着预培养时间的延长先增加后下降的趋势，说明预培养的时间对转化率的影响可能与所选用植物材料等有关系。

本试验成功建立了虎杖茎尖为转化受体、以潮霉素为筛选剂的根癌农杆菌介导的遗传转化体系，但虎杖茎尖的转化率远低于棉花［20］、小麦［9］等作物的茎尖转化效率，所以该遗传转化体系还有待优化。后续工作可以从农杆菌菌株、农杆菌介导法结合漩涡振荡、真空负压处理等方面来进一步优化该转化体系。

本试验希望通过提高关键酶基因PcRS在虎杖中的表达水平，调控虎杖中白藜芦醇的生物合成。PCR和Southern杂交检测，表明外源基因已经整合到转基因植株的基因组中。但是本试验只进行EcoRI 酶的单酶切，还不能准确确认外源基因插入的拷贝数和位点。在后续Southern杂交试验中可以采用多个限制性内切酶进行单酶切，或者采用双酶切。另外转基因植株的遗传稳定性、外源基因的表达、活性成分的含量变化等方面还需要进一步深入研究。

4 结论

采用根癌农杆菌EHA105 菌株侵染虎杖茎尖较适宜的转化系统为：预培养 2 d，农杆菌菌液浓度OD600为0.6，侵染10 min，共培养 3 d，在筛选培养基中添加 8 mg/L潮霉素，待筛选获得的抗性芽生长至 3-5 cm高，再转至根诱导培养基使其长成完整植株。利用该体系成功实现虎杖茎尖遗传转化白藜芦醇合酶基因，本研究结果为拓宽虎杖遗传转化受体提供了技术和方法。

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（责任编辑 狄艳红）

Agrobacterium tumefaciens-mediated Transformation of Shoot Tip of Polygonum cuspidatum

Liu Zhongyu1Zhao Shujin2
（1. College of Life Sciences，Yangtze University，Jingzhou 434025；2. General Hospital of Guangzhou Military Command，Guangzhou 510010）

In order to establish Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation system of Polygonum cuspidatum shoot tip, some key factors that affect transformation frequency of P. cuspidatum shoot tip were studied. The shoot tips of P. cuspidatum was infected by Agrobacterium tumefaciens EHA105 with the plasmid which contains PcRS gene. The superior transformation system was as following, precultured 2 days and then infected 10 minutes in suspension（OD600=0.6）, co-cultured 3 days, transgenic tissues and shoots were selected with 8 mg/L hygromycin. Six transgenic plants from 300 explants were obtained and the intergration of transgene was confirmed by PCR and Southern blot analysis.

Polygonum cuspidatum Shoot tip Agrobacterium tumefaciens Genetic transformation

2013-08-19

广东省自然科学基金（10151001002000012），长江大学博士启动基金项目（801100010122）

柳忠玉，女，博士，讲师，研究方向：中药生物技术；E-mail：zyliu2004@126.com

赵树进，教授，博士生导师，研究方向：生物制药；E-mail：gzzsjzhs@163.com