大群体转基因大麦后代快速筛选研究

李静雯 张正英 王立光 陈军 朱天地

摘要：以攜带有潮霉素标记基因的RNAi转基因大麦和常规大麦为材料，采用叶片涂抹法进行了潮霉素筛选浓度确定及转基因大麦T2代和回交后代的筛选和PCR检测。结果表明，3 000 mg/L潮霉素连续涂抹3次，5 d后转基因大麦涂抹区域无受害症状，生长受害率显著低于无涂抹处理。潮霉素涂抹检测结果与其PCR检验结果的符合度为96.2%，目的基因筛选准确率可达61.8%。表明所建立的活体幼苗潮霉素叶片涂抹法筛选转基因大麦快速，直观、准确，具有一定可行性。

关键词：转基因大麦;潮霉素;潮霉素磷酸转移酶基因;叶片涂抹

中图分类号：S512.3        文献标志码：A        文章编号：1001-1463（2019）08-0012-06

Abstract：Using RNAi transgenic barley and conventional barley carrying hygromycin marker gene as experimental materials， the concentration of hygromycin screening by leaf smearing method was determined， and the screening and PCR detection of T2 generation and backcross progenies of transgenic barley were carried out. The results showed that 3 000 mg/L hygromycin was applied for three times continuously. After 5 days， no symptoms were found in the smearing area of GM barley， and the rate of growth damage was significantly lower than that of non-smearing treatment. The coincidence between the results of hygromycin smear test and those of PCR test was 96.2%， and the accuracy of target gene screening was up to 61.8%. Therefore， the hygromycin leaf smear method for screening transgenic barley was rapid， intuitive and accurate， and had certain feasibility.

Key words：Transgenic barley;Hygromycin;Hygromycin phosphotransferase gene（hpt）;Leave painting

大麦是全球普遍栽培的第四大禾谷类作物，不仅用途多样，而且适应性广，既是粮食和饲料，也是生产啤酒的重要原料，具有良好的耐旱性、耐寒性和耐盐性[1 ]，是遗传和生理研究的模式种类[2 - 3 ]。自1994年首次获得可育转基因大麦植株以来，大麦转基因的研究发展迅速，已成为实现基因功能验证和作物育种的重要方法[4 - 5 ]。随着最近高质量的大麦基因组参考序列的公布[6 - 7 ]，为谷物的全面遗传和基因组研究提供了重要资源，也为大量基因的功能研究提供了基础。

转基因大麦获得后，如何快速有效地从庞大的转基因后代群体中检测出携带有目的基因的转基因植株是转基因大麦研究的重要环节。基于抗生素-筛选标记基因等建立的抗生素筛选体系，由于其经济、简便、直观，对于转基因纯系种质的筛选和转基因亲本与杂交组合纯度的检测具有指导意义[8 ]。大麦转化中潮霉素磷酸转移酶基因Hpt II是采用较多的筛选标记[9 ]，其产物的作用底物潮霉素B（Hygromycin B）是一种氨基糖苷类抗生素，通过竞争叶绿体和线粒体中的核糖体与延长因子EF-2的结合位点，破坏各种细胞中核糖体的功能，从而抑制蛋白的合成，使敏感组织褐化死亡[10 ]。潮霉素通过干扰蛋白质合成以抑制植物生长，可以帮助筛选转化外源基因的细胞、组织和再生植 株[11 - 12 ]。利用潮霉素涂抹叶片快速筛选转基因植株的方法，在水稻与杨树中已有报 道[13 - 14 ]。在转基因大麦中关于潮霉素的研究多见于遗传转化阶段，后代规模化筛选方面的报道较少。我们开展了转基因大麦及常规品种不同浓度潮霉素叶片涂抹的鉴定，并对大群体转基因大麦及回交后代筛选效果进行了研究，以期对实现大群体转基因大麦的快速选择、加快育种进程提供参考。

1   材料与方法

1.1   供试材料

供试大麦品种为甘啤4号，Golden Promise，转基因大麦9份T2代材料（分别为242-01-01、242-03-01、242-06-01、242- 10-01、242-17-01、242-18-01、242-20- 01、242-24-01、242-02-01）以及转基因大麦与甘啤4号回交后代材料1份（RNAi-BC3）。该转基因大麦为甘肃省农业科学院生物技术研究所创制的以“Golden Promise”为受体获得的带有hpt基因的RNAi B-hordein 转基因大麦[15 ]，甘啤4号为甘肃省农业科学院培育的优质啤酒大麦品种[16 - 17 ]，不带hpt基因。试验用潮霉素B由Roche公司生产。

1.2   试验方法

1.2.1    潮霉素篩选浓度的确定    将甘啤4号、Golden Promise及以转基因大麦种植于育苗钵，在温度25 ℃、光照/黑暗16 h/8 h条件下培养。根据预实验结果，共设置了500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、 4 000 mg/L 7个潮霉素浓度。在3叶1心期将配制的Hyg溶液用医用棉签均匀涂抹于第2叶，涂抹区域2 cm左右，以浸润为准，连续涂抹3 d，挂牌标记。涂抹后第5天观察叶片的反应，统计生长受害率，以明确潮霉素涂抹后大麦叶片的变色效果和不同类型大麦幼苗的潮霉素敏感浓度。

1.2.2    潮霉素叶片涂抹筛选法在大麦转基因后代及回交后代筛选中的验证    在确定的筛选条件下，对已导入外源基因hpt和RNAi构件的9个转基因大麦株系的T2代幼苗及回交后代进行抗性筛选，5 d后统计筛选结果。剪取抗性幼苗的新鲜叶片，采用TIANGEN植物基因组DNA提取试剂盒提取大麦基因组DNA作为模板，进行hpt和B-hordein RNAi干涉构件片段PCR检测。潮霉素和目的基因引物序列、反应体系和条件见文献[18 ]。

抗性筛选有效率（%）=（PCR阳性株数/抗性苗数）×100%。

2   结果与分析

2.1   潮霉素涂抹后大麦叶片表现

Hyg涂抹5 d后观察发现，大麦叶片涂抹区域呈现不同程度的受害症状（图1）。大麦叶片对Hyg处理后的最终反应程度划分为3个等级：Ⅰ为涂抹部位叶色正常;Ⅱ为涂抹部位叶片出现点状褐化，叶色仍为绿色;Ⅲ为涂抹部位大片褪绿，叶片黄化，严重者呈灼烧状。甘啤4号及对照Golden Promise涂抹区域黄化，叶片死亡，携带有hpt的转基因大麦涂抹区域叶色正常（图1-a）。

叶片Ⅲ级反应，基本上消除了叶片自身对潮霉素处理的负面效应，可作为潮霉素起始筛选的标准。

2.2   潮霉素筛选浓度的确定

通过表1可以看出，随着筛选浓度升高，大麦品种潮霉素涂抹区域受害程度均加重，生长受害率上升。不同品种大麦幼苗在不同潮霉素涂抹浓度下叶片受害表现有所差异。甘啤4号在2 000 mg/L潮霉素处理后叶片发黄，其生长受害率达100%，显著高于其他处理;Golden Promise大麦叶片在潮霉素浓度≤1 500 mg/L，叶片无伤害，当浓度为2 500～4 000 mg/L时生长受害率各处理无显著差异，但是叶片受害程度不同，浓度为3 000 mg/L以上时叶片灼烧状严重。转基因大麦在3 000 mg/L时叶片涂抹区域无变化。因此确定以3 000 mg/L作为转基因大麦后代筛选浓度。

2.3   潮霉素筛选方法在大麦转基因后代及回交后代筛选中的验证

对RNAi B-hordein转基因大麦9个转化事件T2代材料共计765株转基因后代幼苗于3叶1心期进行3 000 mg/L潮霉素涂抹，5 d后统计筛选结果。结果显示，404株幼苗表现抗性，抗性筛选有效率达96.2%，表明利用3 000 mg/L 潮霉素在3叶1心期涂抹筛选转基因大麦后代是可行的。之后筛选转基因大麦与甘啤4号回交后代（RNAi-BC3）83株幼苗，获潮霉素阳性株42株，抗性筛选有效率达66.7% （表2，图2-A）。

为进一步明确潮霉素PCR阳性株是否存在B-hordein RNAi构件，选取2个转化事件共计170株进行目的基因正反向片段PCR检测，其中105株检测到同时含有醇溶蛋白基因正反向片段，表明潮霉素筛选   B-hordein RNAi 构件的准确率为61.8%。回交后代的目的基因检测准确率为75.0%（表3，图2-B）。

3   小结与讨论

通过对大麦活体幼苗叶片开展潮霉素涂抹筛选研究，建立了潮霉素快速筛选大群体转基因大麦后代的方法。研究表明，在3叶1心期采用3 000 mg/L的潮霉素溶液对嫩叶进行连续3 d的涂抹，根据5 d后叶片涂抹区域受害症状可快速区分转基因植株，潮霉素基因PCR检测符合度可达96.2%，目的基因筛选准确率可达61.8%。该方法筛选转基因大麦后代快速、直观、准确，可行性高。

本研究发现，潮霉素快速选择的效果因涂抹浓度、观测时间变化很大，这与殷奎德等[18 ]的结果一致。首先，只有选择超过转基因大麦自身抗性范围的处理浓度（如大麦敏感型的潮霉素浓度 > 2 000 mg/L）时，才能进行有效筛选，否则会增加假阳性单株的数量，影响选择的效果。其次，叶片生长的不同状态对潮霉素处理结果有很大影响，新展开的叶片对潮霉素较敏感，越老的叶片对其抗性越强，为减少误差应于3叶1心期挑选生长一致的、完全展开的叶片为检测对象，以提高选择的准确性。此外，在潮霉素液中添加粘着剂（表面活性物质）涂抹效果更好。外界天气也会对涂抹效果有影响，如果涂抹期间有雨，最好再行补涂1次。

抗生素标记基因一般都与目的基因以连锁的方式构建在同一T-DNA上[8 ]，理论上目的基因构件存在于筛选出的转基因大麦潮霉素阳性株，但是由于RNAi转基因大麦目的基因PCR反应易于变化，实际操作中需要探索出适合的退火温度等反应条件以便于更好的筛查出目的基因阳性株。

伴随大量的转基因生物产生，标记基因的安全性是转基因食品安全性关注的焦点问题之一。目前已有共转化系统法、转座子系统法、位点特异性重组系统法、重组酶系统法、外源基因清除技术及叶绿体转化技术可培育新的无选择标记的转基因作物[8 ]，但这些技术只适用于新的无标记转基因植株的培育。有研究者认为可通过人工理化诱变，将现有的已经育成有重大应用价值转基因材料中的hpt 基因剔除或部分片段失活[19 ]。此外，在食品安全方面，有研究表明潮霉素蛋白潜在致敏性很低，在加工食品中均已不同程度的发生了降解，对生物安全的影响很 小[20 - 21 ]。

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（本文责编：陈    伟）