鲟鱼种质鉴定方法研究进展

郭向贺董颖胡红霞赵艳珍

（1.河北农业大学海洋学院，秦皇岛 066003；2.北京市水产科学研究所，北京 100068）

鲟鱼种质鉴定方法研究进展

郭向贺1，2董颖2胡红霞2赵艳珍1

（1.河北农业大学海洋学院，秦皇岛 066003；2.北京市水产科学研究所，北京 100068）

鲟鱼是一类古老的大型经济鱼类，由于过度捕捞和人类对其生态环境的破坏及其鲟鱼自身具有的性成熟时间长、幼体成活率低等特点，使世界范围内的鲟鱼自然资源日趋枯竭。人工养殖鲟鱼已是鲟鱼制品的主要来源，但由于种质来源不清及大量杂交鲟的存在导致种质混乱情况比较严重，目前国内外均未有一套比较完善可行的鲟鱼种质鉴定体系。总结了目前进行鲟鱼种质鉴定的一些常用方法，分析了各个方法的优缺点，为确立一套稳定可靠的鲟鱼种质鉴定方法奠定基础。

鲟鱼 种质 鉴定方法

鲟形目（Acipenseriformes）鱼类是现存唯一的大型软骨硬鳞鱼，多数种类具有江河洄游的习性［1］。鲟鱼肉厚鲜美，含丰富的蛋白质［2］，尤其是具有“黑色黄金”之称的鱼子酱，富含人体必需的多种氨基酸和不饱和脂肪酸（EPA、DHA）、无机盐、维生素，以及多种必需微量元素，价格更是不菲［3］。但由于人类活动的影响致使鲟鱼野外种质资源急剧下降，鲟形目多数种处于濒危或极危状态［4］。

随着人们对鲟鱼以及鲟鱼鱼子酱需求的增长，人工养殖鲟鱼已经成为鲟鱼制品的主要来源［5］。虽然鲟鱼养殖规模越来越大，但由于没有规范的养殖引种制度，而且国内外目前也还没有一套完整的鲟鱼种质鉴定体系［6］，使得鲟鱼种质现状繁杂，不利于鲟鱼产业的进一步发展。为规范鲟鱼贸易以及防止非法捕捞和交易，急需建立一套完整的鲟鱼种质鉴定体系。目前，对鲟鱼进行种质鉴定主要有形态学、SSCP、RAPD、RFLP、AFLP、微卫星及物种特异性PCR等多种方法。本文主要对现在已有的各种鲟鱼种质鉴定方法的应用情况和优缺点进行综述，以期为鲟鱼种质鉴定找出最优方案提供参考。

1 鲟鱼现状

鲟鱼在早侏罗世已经存在（距今1.9-1.4亿年），素有“活化石”之称［7］。鲟鱼隶属于硬骨鱼纲（Osteichthyes）、辐鳍亚纲（Actinopterygii）、硬鳞总目（Chondrostei）、鲟形目（Acipenseriformes）。现存的鲟鱼有2科6属27种，其中鲟科（Acipenseridae）有鳇属（Huso）2种、鲟属（Acipenser）18种、铲鲟属（Scaphirhynchus）2种、拟铲鲟属（Pseudoscaphirhynchus）3种；白鲟科（Polyodontidae）有白鲟属（Psephurus）和匙吻鲟属（Polyodon）各1种［8］。鲟鱼主要分布在北回归线以北的亚洲、欧洲和北美洲［9］。但是近几年由于人类过度捕捞以及鲟鱼栖息地被大型水利工程的兴建和水环境污染等外界因素破坏，以及鲟鱼性成熟晚、个体大且幼鱼成活率低等因素，使得野生鲟鱼种群数量急剧减少，已被列为《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录Ⅱ物种［10］。

鲟鱼野生资源日益枯竭的同时，由于其重要的经济价值，市场对鲟鱼产品的需求却逐年增加。因此人工养殖就成为解决鲟鱼资源保护和市场需求间矛盾的唯一方法，前苏联、欧洲各国、美国及伊朗等国都相继开展了鲟鱼的人工养殖。我国从20世纪90年代开始开展鲟鱼人工养殖，目前年产鲟鱼商品鱼约3万 t，占世界总养殖产量的80%左右，已经成为了世界上最重要的鲟鱼生产大国。但是现存的鲟鱼都是多倍体，彼此间极易进行杂交，且产生的杂交种很难区分。而不同种类鲟鱼及其杂交种的生长速度和适应条件各不相同，其经济价值也不尽相同。例如，不同品种鲟鱼卵加工制成的鱼子酱的价格就相差悬殊，欧洲鳇的鱼子酱价格超过5 000美元/kg，俄罗斯鲟的鱼子酱约为4 000美元/kg，西伯利亚鲟的鱼子酱约为3 000美元/kg，而小体鲟的鱼子酱基本没有市场。因此，进行正确的鲟鱼种质鉴定是解决因种质混乱引起的纠纷及提高鲟鱼产业价值的有效途径。

2 种质鉴定方法

鲟形目自被记录以来，人类发展出多种鲟鱼的种质鉴定方法，从传统的形态学到最新的分子生物学手段都有，本文就各个方法的应用以及优缺点进行了概述。

2.1 形态学

动物形态学是生物学中具有悠久发展历史的一门学科，从公元前4世纪亚里斯多德关于动物解剖的试验记录开始，到达尔文进化论使得动物形态学进入崭新时期，再到20世纪初宏观形态学研究的深入，已发展成为包括解剖学、比较解剖学、细胞学和组织学、古动物学和胚胎学等的综合性学科［11］。形态学方法可简单概括为可数性状、可量性状、结构特征等［12］。

Vasil'eva［13］根据鳃耙正面及侧面的形态结构将其现有鲟鱼分为4个类群，其鳃耙结构分别为圆锥形、扁宽形、树形及钩形。Artyukhin［14］通过比对嘴型、吻须位置、第一背骨板是否最大、卵的大小等28处形态学特征，对包括小体鲟、施氏鲟、达氏鳇、俄罗斯鲟等23种鲟属进行了区分，并对形态学鉴定与分子鉴定的部分结果相悖的现象进行了解释。陈细华［15］对27种鲟鱼从受精卵到成体的形态学特征进行了详细的描述及对比。

Gao等［16］利用中华鲟红细胞的密度比其他鲟鱼高的特点将其与其他鲟鱼进行区分，Artyukhin等［17］从形态学角度对6种太平洋鲟鱼进行研究，并讨论库页岛鲟在分类学的地位。张颖等［18］利用施氏鲟（♂）×达氏鳇（♀）杂交鲟特有表型将其与亲本进行区分，虽然杂交鲟形态与母本更为接近，但仍可以通过比对头部特征以及胸鳍、侧骨板数、臀鳍条数等7项可数特征进行区分。

形态学方法虽然具有简单、直观等优点，但因其判断的主观性强，需要较专业的系统学知识，且因地理隔绝或同种鲟鱼不同发育阶段形态学也有差异等因素的存在极易造成错判，另外形态学也较难区分多种多样的杂交鲟。

2.2 PCR-RFLP

限制性内切酶片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）作为第一代DNA遗传标记法，由Grodjicker等［19］于1974年提出，是利用限制性内切酶消化不同品种或个体的同源分子，经电泳分离出不同的限制性片段。特别是RFLP与PCR结合，使得DNA多态性检测更加直接、快速。

PCR-RFLP技术具有以下优点：第一，可靠性较高，因为它由限制性内切酶切割特定位点产生；第二，来源于自然变异，依据DNA上丰富的碱基变异不需任何诱变剂处理；第三，多样性，通过酶切反应来反映DNA水平上所有差异，在数量上无任何限制；第四，共显性。但该技术的缺点是操作烦琐，相对费时，具有种属特异性，并且可能因为碱基突变而导致限制性酶切位点的丢失或获得。

PCR-RFLP已应用到多种鱼类的种质鉴定中，如大马哈鱼［20］、金枪鱼［21］、海鲈［22］、鳕鱼［23］等。在鲟鱼种质鉴定中，PCR-RFLP技术主要被用来进行鱼子酱品种的鉴定。Wolf等［24］利用不同限制性内切酶对俄罗斯鲟、施氏鲟、小体鲟、西伯利亚鲟等十种鲟鱼的线粒体细胞色素b序列进行酶切，结果可以用于区分这些鲟鱼的鱼子酱制品。Ludwing等［25］利用7种限制性内切酶成功鉴别出22种鲟鱼中的17种。

2.3 PCR-SSCP

单链构象多态性分析（Single-strand conformation polymorphism，SSCP）是在1989年由日本学者Orita等［26］提出的，根据碱基改变会影响单链DNA空间构象的原理，使得空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受到不同阻力，导致电泳速度不同，经染色后就可以在凝胶上面检测出结果。

PCR-SSCP具有以下优点：第一，操作简单，不需要特别仪器，技术容易掌握；第二，试验步骤少，周期短；第三，可用非同位素方法检测；第四，对己知和未知基因变异的检测均有效，对DNA 原始材料纯度要求不高，且所需量较少；第五，适合于大样本筛查，特别适用于混合细胞群体中DNA 变异的检测；第六，可分析DNA的多态性和DNA的突变［27，28］。但PCR-SSCP也具有不能识别碱基突变位置、较适用于300 bp短链DNA分析、结果易受多种因素影响等缺点。

Hara等［29］最先利用PCR-SSCP技术进行鱼类鉴别。随后，Rehbein等［30］利用PCR-SSCP技术进行了金枪鱼的种质鉴定。Rehbein等［31］利用PCRSSCP技术对冷冻的4种鳗鱼（欧洲鳗（Anguilla anguilla）、日本鳗（A.japonica）、美洲鳗（A.rostrata）、澳洲鳗（A.australis））和4种鲑鱼（溪红点鲑（Salvelinus fontinalis）、褐鲑（Salmo trutta）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、大西洋鲑（Salmo salar））的肌肉组织、3种鲟鱼（欧洲鳇、俄罗斯鲟和闪光鲟）的鱼子酱以及沙丁鱼、鲱鱼、鳕鱼、金枪鱼和鲣鱼的罐头样品进行种类鉴定，结果表明4种鳗鱼在两个条带处差异明显，5种鲑鱼在3对引物扩增后可快速鉴别出，3种鲟鱼的条带差异明显，其中欧洲鳇在不用DNA变性的情况下可轻易获得指纹图谱，其他的罐头样品也可从两个条带的强弱进行区分。Rehbein等［32］利用线粒体细胞色素b区域扩增出的两段序列进行PCR-SSCP分析，可以对俄罗斯鲟、小体鲟、欧洲鳇、闪光鲟和裸腹鲟的鱼子酱进行区分，这两段扩增序列（小于150 bp）既保证了单个碱基替换对单链DNA空间结构的影响，同时也可以降低过长片段对种内鉴定的误差。

2.4 RAPD

随机扩增多态性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技术是由Williams［33］和Welsh［34］在1990年分别提出的，它的原理是：对于同一模板DNA，用一个特定引物进行扩增所得到的电泳带谱应是一致的，引物不同则带谱就会有差异。该技术利用大量各不相同的随机短引物（8-10 bp），以待研究的基因组DNA片段为模板进行PCR扩增，扩增产物经电泳分离后即可进行多态性分析。RAPD技术具有以下优点：第一，操作简便，试验周期短，能在较短的时间内筛选大量样品；第二，所需样品量极少；第三，引物具普遍适应性；第四，不必事先了解目的基因和片段序列；第五，适应于自动化操作和分析。但该技术的缺点是结果不易重复、多态性较低，而且是显性标记。

RAPD技术已经被用于鲤鱼［35］、鲶鱼［36］、罗非鱼［37］、古比鱼［38］等鱼类的种质鉴定中。Van等［39］利用RAPD技术成功区分出白鲟的雌核发育和多倍体群体。而Comincini等最早将RAPD技术用于鲟鱼的种质鉴定，成功对俄罗斯鲟、波斯鲟、闪光鲟、裸腹鲟等进行鉴别［40］。Barmintsev等［41］将该技术进一步发展，使其不仅适用于鲟鱼的种质鉴定，还适用于对鲟鱼种群、杂交种甚至是鲟鱼制品的鉴定。

2.5 AFLP

扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）技术结合了RFLP和RAPD各自的优点，是由Zabeau和Vos［42］在1993年发明并发展起来的一种检测DNA多态性的技术。其基本原理是模板DNA由于突变等原因导致酶切位点的改变，因此在限制性内切酶的作用下将产生大小不等的片段，从而反映模板DNA的多态性。AFLP技术具有需要DNA量小、扩增效率高、多态带比例高、可靠性好、样品适用性广、稳定遗传等优点。但其缺点是它不是共显性标记，且对模板DNA的质量要求较高。

AFLP技术已用于虹鳟鱼［43］、鲶鱼［44］、罗非鱼［45］等鱼类的种质鉴定。Congiu等［46］最先利用AFLP技术成功区分高首鲟、纳氏鲟及其杂交品种。而后，AFLP技术被用于对小体鲟、俄罗斯鲟、高首鲟、欧鳇、欧洲大西洋鲟、大西洋鲟、纳氏鲟、闪光鲟、短吻鲟和西伯利亚鲟等进行区分，并延伸到对鱼子酱和熏鱼肉等鲟鱼制品的鉴别［47］。

2.6 微卫星

微卫星DNA标记（Microsatellite），也称为短串联重复序列（Simple tandem repeats，STRs）或简单重复序列（simple sequence repeats，SSRs），最先由Litt等［48］提出，一般以2-6个碱基为核心序列，首尾相连串联重复，存在于几乎所有真核生物的基因组中，丰度高，且呈随机均匀分布［49］。微卫星具有数量多且分布均匀、多态性丰富、共显性遗传、遵循孟德尔遗传定律以及具有一定的保守性等优点。其缺点是特异性引物的筛选费时费力，以及可能产生同源异型或者异源同型现象等。

微卫星多被用于遗传多样性分析，但也可用于种质鉴别。Maltagliati等［50］利用微卫星标记对地中海濒危鱼类西班牙鳉（Valencia hispanica）、利氏西班牙鳉（V. letourneuxi）和斑条秘鳉（Aphanius fasciatus）进行区别。Jenneckens等［51］发现一个具有种特异性的微卫星引物用来鉴别闪光鲟及其鱼子酱制品。胡佳等［52］采用微卫星标记结合线粒体控制区同源序列比对的方法，可以很好地鉴别出施氏鲟、达氏鳇及其正反交子代。

2.7 物种特异性PCR

物种特异性PCR技术是通过对需要辨认的物种及其近缘种的某段序列进行比对，根据PCR引物设计原则针对其中有差异的区域设计引物，从而得到具有物种特异性的引物，使得在PCR反应过程中只有目的物种的DNA可以与引物正常退火并延伸，而其他物种的DNA不能与引物匹配或匹配后扩增得到的产物与目的物种的扩增产物存在较大的长度差异，通过是否扩增成功或其产物的大小差异来鉴定目的物种。物种特异性PCR技术具有操作简单、物种特异性强以及高灵敏度等特点，但由于其主要以线粒体DNA作为种质鉴定的模版来源，而鉴于线粒体DNA母系遗传的特点［53］，此方法无法用于鉴别杂交种。

Hubalkova等［54］利用Pan Ⅰ序列设计的物种特异性引物对阿拉斯加狭鳕（Theragra chalcogramma）、蓝鳕（Micromesistius poutassou）、无须鳕（Merlucciusspp.）、大西洋真鳕（Gadus morhua）、绿青鳕鱼（Pollachius virens）和牙鳕（Merlangius merlangus）进行扩增，成功对上述几种鳕鱼进行了区分。其他可以利用物种特异性PCR进行种质鉴别的还有鲣鱼［55］、鲨鱼［56］、三文鱼和鳟鱼［57］等。DeSalle和Birstein等［58，59］利用物种特异性PCR对俄罗斯鲟、闪光鲟、欧洲鳇等进行了种质鉴定。Mugue等［60］利用线粒体DNA的D-loop片段特性设计的物种特异性引物对俄罗斯鲟、达氏鳇、小体鲟、西伯利亚鲟、欧洲鳇、施氏鲟、闪光鲟和裸腹鲟等八种鲟的鱼子酱产品进行鉴定。

2.8 实时定量PCR

Higuchi 等［61］首次利用EtBr（溴化乙锭）演示了实时定量PCR（Quantitative real-time PCR）的实时过程，典型的实时定量PCR方法包括引物的设计与合成、反转录合成cDNA、PCR反应混合液的配制、核酸扩增、DNA条带检测等几步。实时定量PCR检测技术具有快速、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。

实时定量PCR技术已被成功应用于黑线鳕（Melanogrammus aeglefinus）［62］、欧洲无须鳕（Merluccius merluccius）［63］、 大 西 洋 鳕（Gadus morh-ua）［64］、金枪鱼［65］、三文鱼和鳟鱼［57］等鱼类的种质鉴定中。虽然目前尚未见到其在鲟鱼种质鉴定中的应用报道，但作为一种有效的鱼类种质快速检测技术，其发展前景十分可观，可作为进行鲟鱼种质鉴定的候选技术。

2.9 DNA-barcoding

DNA条形码（DNA-barcoding）技术自加拿大动物学家Hebert等［66］提出以来，已被广泛应用在鸟类、哺乳动物、鱼类、软体动物及昆虫等不同生物群体中。该技术主要利用线粒体COⅠ序列很少存在插入和缺失等现象，且长度适合及进化率低等特点，利用其中一段短的DNA序列作为物种快速鉴定的标记，并希望以此建立起物种名称（条形码）和生物实体之间一一对应的关系［14］。DNA条形码技术具有鉴定过程快捷、准确率高等优点。

Ward等［67］利用DNA条形码技术对澳大利亚273 种鱼类的COⅠ基因序列进行了分析，不仅成功鉴别出这些鱼类，而且还对其系统发育进行了研究，对了解其进化历程提供了信息参考。程鹏等［68］对北京市怀柔区的53种鱼类进行了研究发现，条形码鉴定与形态鉴定基本一致，同时DNA条形码技术还弥补了传统形态学鉴别的缺陷，为鱼类保护以及新物种的发现提供了新的解决方法。

虽然DNA条形码技术存在包括条形码数据库缺乏、无法鉴别杂交种、条形码价格昂贵等缺点，但该技术已经成为生态学研究和物种鉴定的重要工具。同时，由于其具有的良好对应性，即一段条形码只对应一个物种，使得其可能成为世界通用的种质鉴定标记，特别是在鲟鱼鱼子酱的全球贸易中具有巨大的应用前景，将成为研究的热点之一。

3 展望

与大多数鱼类不同，鲟形目鱼类种间甚至属间的杂交现象极为普遍，且部分杂交种仍可育，产生三杂交后代，这为进行鲟鱼种质鉴定造成了极大的困难。通过对上述几种鲟鱼种质鉴别方法的综述发现，目前还没有一种方法适用于所有鲟鱼品种的种质鉴定，但可以对比几种常用的种质鉴定方法的优缺点，利用优缺点互补的原则通过两种或多种方法相结合，找出最优组合，使之适用于对所有鲟鱼特别是杂交鲟品种进行种质鉴定。由于不能辨别父本，单独使用遵循母系遗传的线粒体DNA标记不能区分出杂交鲟；而利用核DNA标记（如微卫星、AFLP等）虽然可以知道亲本种类，但不能明确哪个是父本哪个是母本。因此，我们认为应该将线粒体DNA标记与核DNA标记结合使用，即先通过线粒体DNA标记确定母本种类，再通过核DNA标记确定父本种类并最终确定样本的种类，这可能是准确进行鲟鱼种质鉴定的好方法。但是究竟选取哪些核DNA标记以及线粒体的哪个区域进行分析还需要进一步的验证。

另外，将PCR技术与高分辨率的色谱和质谱技术相结合，可作为未来鲟鱼种质鉴定的探索方向。而具有快捷、准确率高等优点的实时定量PCR技术和DNA条形码技术也可能成为未来鲟鱼种质鉴别，特别是鱼子酱产品鉴别的热点技术。

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（责任编辑 狄艳红）

Research Progresses of Germplasm Identification Methods in Sturgeons

Guo Xianghe1，2Dong Ying2Hu Hongxia2Zhao Yanzhen1
（1. Ocean College，Agricultural University of Hebei，Qinhuangdao 066003；2. Beijing Fisheries Research Institute，Beijing 100068）

Sturgeon is a kind of large economic fish. Due to overharvesting, habitat destruction and their biological characteristics such as sexual maturation at a late age and low survival rate of larvae, sturgeon natural resources in the world were depleting. In order to meet the needs of sturgeon caviar and meat, artificial cultivations were developed and had been the main source of sturgeon products. So far, there was not yet a perfect germplasm identification method in sturgeons at home and abroad. Some common sturgeon germplasm identification methods were summarized. The advantages and disadvantages of each method were analyzed and listed. It was helpful to establish a stable and reliable sturgeon germplasm identification method.

Sturgeon Germplasm Identification methods

2013-08-26

北京市科技计划（D121100003712002），北京市鲟鱼鲑鳟鱼创新团队（SCGWZJ 20121102-1），科技部支撑计划（2012BAD26B05）

郭向贺，男，硕士研究生，研究方向：鱼类遗传育种；E-mail：guoxianghe@126.com

胡红霞，女，博士，研究员，研究方向：鱼类遗传育种；E-mail：huhongxia@bjfishery.com

赵艳珍，女，副教授，研究方向：水生生物种质资源和渔业环境及其调控；E-mail：zhaoyanzhen5532@163.com