外源性神经生长因子对雪旺细胞中NF-κB mRNA 表达的影响

辛林伟，王梨明，唐际存，李朝旭，李 强

(桂林医学院附属医院，广西桂林540001)

周围神经组织特有的再生机制可以使神经营养因子向导管内聚集，为神经创造良好的再生环境［1～3］。搭建周围神经组织的主要细胞是雪旺细胞(SCs)，它是周围神经组织特有的胶质细胞。正常SCs具有相当高的稳定性，但当周围神经受损时，SCs可大量分泌多种内源性神经营养因子［4，5］，如神经生长因子(NGF)等，而这些因子是创立和维持周围神经组织再生的主要活性物质，但外源性NGF对SCs的影响报道较少。为此，我们观察了外源性NGF对SCs中核转录因子 κB(NF-κB)mRNA表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 2～3月龄新西兰家兔20只，体质量2～3 kg，适应性饲养1周。主要仪器及试剂:目乐手术显微镜(德国麦迪塞姆仪器有限公司，FS3013)、倒置相差显微镜与成像系统(日本Nikon，TE-2000-U)、荧光显微镜(日本 Olympus，BS51)、酶标仪(美国伯乐，Bio-Rad680)、定量 PCR仪(美国 ABI，7500Fast)、反转录试剂盒(日本 TAKARA，Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)兔抗鼠S-100多克隆抗体、兔抗鼠NGF多克隆抗体(美国santa cruz)。

1.2 方法

1.2.1 SCs原代培养及分组 选择健康家兔10只，用5%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，无菌条件下，暴露并截取部分坐骨神经进行原代培养。差速贴壁法分离纤维母细胞，并加入G-418对成纤维细胞进行抑制，放于37℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后倒置相差显微镜下观察其生长情况。待培养细胞在培养瓶底已铺满80%～90%，即可进行传代。

1.2.2 免疫组化染色鉴定细胞纯度 取第4代细胞爬片进行S-100免疫组化染色鉴定。按1×105/孔将细胞悬液接种到培养板上，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞长成单层时，进行S-100免疫组化染色鉴定。随机选取10个不重叠高倍视野进行阳性细胞计数，并计算阳性细胞率。

1.2.3 NF-κB mRNA表达检测 取第4代优质细胞，随机分为实验组(NGF)、阻断组(NGF和anti-NGFR)、对照组(PBS)。置于37℃ 5%CO2的培养箱中培养5 d。按Trizol说明书提取细胞总mRNA，溶解在DEPC水中，分别用紫外分光光度计、1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果。

根据PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA E-raser的说明书合成cDNA，取2 μL产物进行PCR扩增。使用 Primer Express2.0设计合成引物。NF-κB:上游引物:5'-GAGCCACCAATCCACACAGAGT-3'，下游引物:5'-ATGAGCTTCTGGCGTTTCCTCT-3'，扩增片段107 bp;β-actin:上游引物:5'-CATTGCTGACAGGATGCAGAAG-3'，下游引物:5'-GAGCCACCAATCCACACAGAGT-3'，扩增片段108 bp。反应条件:50℃ 2 min，90 ℃ 10 s，95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，扩增40个循环。将扩增的PCR产物行溶解曲线分析，单峰曲线为扩增产物单一，无非特异性扩增产物。其溶解程序为:95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60 ℃ 15 s。反应结束后，取5 μL PCR 产物在2.0%琼脂糖凝胶中进行电泳，并照相记录。上述过程中需要对荧光进行收集，采用SequenceDetection Software2.2软件在全部反应结束后进行数据分析。设定阐值后，对所有样品中NF-κB进行PCR扩增，达到闭值时的Ct值进行测定;通过β-actin进行校正，得到 NF-κB mRNA 相对表达量，即 NF-κB/β-actin。

1.2.4 统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件，符合正态分布数据以±s表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外培养的SCs形态特点 接种24 h后，倒置显微镜下可见两种贴壁生长的、具有明显形态的SCs，一种胞核为长形或圆形，胞体为立体感强、非常饱满的梭形体，两端有细长的突起;另一种胞核很浅，具2～3个核仁，胞体扁平、大且不规则，常常出现多而短的突起。

2.2 SCs纯度鉴定 S-100免疫组化染色可见，SCs胞核比胞质着色浅;边界异常清晰，多数细胞呈梭状，胞体两端有数量不等的突起，形态与活体SCs相同。200倍镜下随机选择10个不重叠的视野，对胞质为棕褐色的阳性细胞进行计数，SCs纯度达到91%。

2.3 各组SCs内NF-κB mRNA表达比较 紫外分光光度计观察显示，A260/A280为 1.8～2.2;1.5% 琼脂糖凝胶电泳可见28、18 s两条清晰条带;证实提取的mRNA质量良好。NF-κB与β-actin扩增溶解曲线为单峰形式，表示扩增PCR产物单一。对照组、阻断组、实验组SCs中NF-κB mRNA相对表达量分别为(8.01 ±0.92)×10-4、(7.86 ±0.14)×10-4、(10.94 ±1.12)×10-4。实验组 NF-κB mRNA相对表达量明显高于对照组、阻断组(P均 ＜0.01)，而阻断组和对照组比较无统计学差异。

3 讨论

SCs体外培养和纯化是研究人体周围神经组织修复功能、分泌蛋白的重要前提。大量动物实验表明，动物的年龄、材质的提取部位对体外培养SCs的质量影响较大［6，7］。在进行 SCs体外培养的过程中，排除其他细胞(如成纤维细胞)是获得高纯度SCs的重要保证。本实验先采用差速贴壁和低浓度消化酶进行纯化，再利用小浓度G-418清除残留的成纤维细胞，因而可获得较高纯度的SCs。在对体外培养的SCs进行鉴定时，采用了形态学和免疫学两种方法，结果显示，体外培养的SCs在镜下多数胞核呈卵圆形或长形，体型为饱满的、立体感极强的梭形，有2～3个细长的突起，多为双极。这与已被证实的 SCs形态相符［8，9］。另外，应用S-100从免疫学角度对培养的SCs进行鉴定，可见到经典的SCs着色形态。证实了本研究成功建立了SCs体外培养的细胞模型。

NGF是SCs分泌的神经营养因子之一，具有维护正常周围神经细胞存活、促进神经纤维快速生长、修复髓鞘等作用。NGF通过两类跨膜糖蛋白受体发挥其生物学功能，即高亲和力酪氨酸激酶受体(Trka)和低亲和力的p75受体［10，11］。其中p75受体属于肿瘤坏死因子受体超家族的成员，对细胞的存活、增殖、分化、迁移、凋亡等起着重要的介导作用。近年研究发现，p75受体还能在Trka受体缺乏时，与NGF结合共同激活NF-κB发挥重要的细胞信号传递通路作用，继而调节一系列基因转录、表达;添加外源性NGF可以上调NF-κB mRNA的表达。这可能是由于周围神经受损后，SCs表面出现大量p75受体，而加入适量外源性NGF后，其与p75受体大量结合，促进了NF-κB mRNA的表达，加强SCs增殖及其抗凋亡的作用。

总之，我们认为外源性NGF可以上调SCs中NF-κB mRNA 的表达。

［1］沈尊理.组织工程化人工神经研究［J］.组织工程与重建外科杂志，2006，2(4):181-183.

［2］李强，李民，伍亚民.神经组织工程研究进展［J］.中国矫形外科杂志，2003，11(4):264-266.

［3］肖峰，郑启新.构建组织工程化神经中生物支架材料的研究进展［J］.生物骨科材料与临床研究，2006，3(4):29-30.

［4］Gavazzi I，Cowen T.Can the neurotrophic hypothesis explain degeneration and loss of plasticity in the mature and aging autonomic nerves［J］.J Auton Nerv Syst，1996，58(1-2):1-10.

［5］Heumann R，Korsching S，Bandtlow C，et al.Changes of nerve growth factor synthesis in nonneuronal cells in response to sciatic nerve transection［J］.J Cell Biol，1987，104(6):1623-1631.

［6］Casella GT，BungeRP，Wood PM.Improved method for harvesting human Schwann cells from mature peripheral nerve and expansion in vitro［J］.Clia，1996，17(4):327-335.

［7］潘良春，尹宗生，王伟，等.新生和成年大鼠雪旺细胞培养、纯化的实验研究［J］.中国康复医学杂志，2005，20(11):817-819.

［8］张军，许百男，周定标.乳鼠雪旺细胞的培养和纯化［J］.解放军医学杂志，2002，27(7):150-155.

［9］黄小强，罗卓荆，李明全.新生SD大鼠坐骨神经雪旺细胞培养与纯化的方法学研究［J］.中华创伤骨科杂志，2005，7(4):341-342.

［10］Metsis M.Genes for neurotrophic factors and their receptors:structure and regulation［J］.Cell Mol Life Sci，2001，58(8):1014-1020.

［11］Barker PA.p75NTR is positively promiscuous:novel partners and new insights［J］.Neuron，2004，42(4):529-533.