肺巨细胞癌细胞与支气管上皮细胞分泌蛋白质的差异分析

李雪华，谷彦军，刘 静，刘燕青

(1武警后勤学院附属医院，天津300162;2天津市职业与环境危害防制重点实验室)

肺癌的早期诊断至关重要，至今未找到能够早期较好地发现肺癌的检测方法［1，2］。近年来，蛋白质组学的研究为肺癌诊断标志物的发现提供了新的思路，故寻找肺癌相关蛋白质，进一步确立肺癌早期诊断标志物，是目前亟需解决的问题。2011年4月～2014年3月，我们观察了肺巨细胞癌细胞株和支气管上皮细胞株分泌蛋白质的差异，为进一步确定肺癌早期诊断相关蛋白标志物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 肺巨细胞癌细胞株95C和支气管上皮细胞株16HBE购自中国医学科学院肿瘤细胞库。等电聚焦仪(Protean IEF cell)、垂直电泳系统(proteanⅡxi cell)均购自Bio-Rad公司。固相pH梯度干胶条(pH 4～7，17 cm)、IEF buffer(pH 3～10)为 Bio-Rad公司产品;碘乙酰铵、尿素、二硫苏糖醇(DTT)等均为Sigma公司产品;1640培养基、胎牛血清为Gibco公司产品。图像分析软件为PDQuest8.0。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 肺巨细胞癌细胞株95C和支气管上皮细胞株16HBE用含10%胎牛血清的1640培养基于37℃、5%CO2条件下常规培养。待细胞长满培养瓶，弃去培养基，PBS冲洗5次，加入无血清培养基再培养24 h，收集上清液，-80℃保存备用。

1.2.2 双向电泳(2-DE)2-DE方法参照仪器操作手册和文献［3～5］进行。200 μg 蛋白质与上样缓冲液充分混合，总体积为500 μL，上样，固相pH梯度干胶条重水化16 h后等电聚焦电泳。电泳完毕，将胶条立即在平衡液A(6 mol/L尿素、2%十二烷基硫酸钠、pH 8.8、0.05 mol/L Tris-HCL、20% 甘油、2%DTT)中平衡15 min，再于平衡液B(以2.5%碘乙酰胺替换平衡液A中2%DTT)中平衡15 min。平衡后进行垂直板SDS-PAGE电泳。然后将2-DE所得凝胶按文献［6～8］进行硝酸银染色。用透射扫描仪扫描染色后的2-DE凝胶。

1.2.3 凝胶图像分析 用PDQuest8.0软件分析扫描后的凝胶图像。比较两细胞株分泌蛋白质的2-DE图谱，寻找差异蛋白质点。蛋白的相对表达量升高3倍或者降低2/3为差异点。

2 结果

2.1 分泌蛋白质2-DE图谱建立 能够获得比较稳定的两细胞株分泌蛋白质的2-DE图谱，平均蛋白质点约200个。

2.2 分泌蛋白质2-DE图谱差异分析 软件分析显示，两细胞株共发现差异蛋白质点7个，肺巨细胞癌细胞株特有的差异点4个，量下调的差异点3个。

3 讨论

目前，肺癌的诊断主要通过影像学检查、纤维支气管镜及活体组织检查，早期确诊率不高，常常在确诊时已达晚期，失去早期治疗的机会。因此，寻找新的肺癌标志物是目前亟待解决的问题。

近年来，肿瘤蛋白质组学为肺癌的早期诊断研究提供了新思路。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，应用相关研究技术，从整体水平上来认识蛋白质的存在及活动方式［9～11］。2-DE和质谱是蛋白质组学研究的核心技术［12］。肿瘤蛋白质组学主要运用蛋白质组学相关技术发现肿瘤相关蛋白质，继而研究其特性、结构和功能。

肿瘤在发生、发展过程中会分泌蛋白质进入血液。理论上，血清中肺癌细胞分泌的蛋白质的出现会早于X线上可见肿块的形成。因此，肺癌细胞分泌的特异性蛋白质不但可以作为潜在的肺癌诊断标志物，而且对肺癌的早期筛选具有重要意义。

本研究比较了肺巨细胞癌细胞株95C和支气管上皮细胞株16HBE分泌的蛋白质差异，寻找肺癌相关特异性蛋白质。在前期建立了稳定性、重复性较好的蛋白质2-DE技术基础上［13］，利用2-DE分离分泌的蛋白质;建立了两细胞株分泌蛋白质2-DE图谱;通过PDQuest8.0软件寻找差异蛋白质，发现肺巨细胞癌特有的差异蛋白质点4个，量下调的蛋白质点3个。肺癌特有的蛋白质是癌细胞分泌、释放的，可能与肿瘤的发生、生长或转移密切相关;而量下调的蛋白质有可能是一些抑癌基因作用的结果或者是一些对肿瘤生长或转移起到调节作用的蛋白质。

总之，筛选出的这些差异蛋白质可能是肺癌发病或病程进展的重要相关蛋白质，对肺癌的早期筛选具有重要意义，有可能作为肺癌早期诊断的血清标志蛋白质。

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