抗HIV-1基因治疗新进展

田雅茹 焦艳梅 张 彤 吴 昊

(首都医科大学附属北京佑安医院感染中心，北京100069)

获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是人类感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)后导致免疫缺陷，并发一系列机会性感染及肿瘤，严重者可导致死亡的综合征。该病传播速度快、病死率高，是危害极大的传染性疾病之一。HIV主要有2种类型:HIV-1和HIV-2，其中HIV-1是引起艾滋病的主要病原。因此，目前艾滋病的防治研究主要是针对HIV-1进行的。自从20世纪90年代后高效抗反转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy，HAART)应用于艾滋病的临床，使HIV-1患者的病毒载量下降及CD4+T细胞水平升高［1］，降低了HIV的发病率和病死率，显著地改变了HIV-1感染者发展到AIDS的进程，但是HAART需要坚持终身用药，这会引发药物不良反应、病毒耐药突变和经济负担等问题［2］。长期药物治疗会出现一些合并症，包括心血管疾病、肝衰竭以及HIV相关神经认知功能障碍［3-5］，而且即使在HAART治疗的前提下，一些患者体内仍然存在持续低浓度的病毒血症［6］。鉴于HAART的这些局限性及人们对抑制HIV-1感染机制理解的增加，研究者们开始致力于抗HIV-1的基因治疗，即将人工合成的外源基因通过基因转移技术导入靶细胞中，以外源基因的表达产物使靶细胞抵抗HIV-1的感染。基因疗法无论是作为独立的治疗方法，还是作为药物的辅助方案，都显示良好的发展前景。本文主要对近5年来该领域中的一些治疗策略的新进展进行综述，包括:①基于RNA的抑制剂，如反义RNA、RNA干扰、核酶、RNA诱饵和RNA适体;②基于蛋白的抑制剂，如显性阴性突变体蛋白、细胞内抗体、细胞内趋化因子、融合抑制剂和锌指核酶。同时探讨了基因治疗的应用策略及目前转基因方法的发展情况。

1 基于RNA的抑制剂

1.1 反义RNA

反义RNA(antisense RNA)是指与mRNA或DNA互补的小单链RNA分子，通过碱基配对形成mRNA/RNA或DNA/RNA的杂交双链，从而抑制基因表达并加速其降解。天然的反义RNA广泛存在于各类生物中，是细胞基因表达调控的一种方式。近几年来很多研究［7-8］通过人工合成的反义 RNA靶向HIV-1蛋白及靶细胞受体等的基因，与靶基因配对形成无功能的双链从而封闭或调节靶基因功能及产物表达，有效地阻断HIV在细胞中的复制。

Levine等［7］构建了一种条件复制型慢病毒载体，表达靶向HIV-1包膜蛋白RNA的长的反义RNA，并用这个载体转染自体CD4+T细胞后再回输到患者体内。Tebas等［8］在对后续的研究中发现大多数这些患者在停止抗反转录病毒治疗后，其病毒载量下降，有一个患者测不出HIV-1 RNA的时间长达104 d。目前这些反转录产物抑制HIV-1复制的实际机制还不明确，可能涉及促使HIV反义双链的大量腺苷脱氨基，从而导致细胞核转录停滞或者产生大量病毒无效突变。

1.2 RNA干扰

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指小双链RNA在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA降解，抑制相应基因的表达，从而引起转录后基因沉默的现象［9］。目前研究的有微小 RNA(microRNA，miRNA)、小干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)、短发夹 RNA(short hairpin RNA，shRNA)均能够介导RNA干扰作用。miRNA是一类广泛存在于真核生物中的单链非编码小分子RNA，通过与细胞内靶mRNA 3'端-UTR区不完全互补配对或与靶mRNA完全互补配对来发挥抑制mRNA翻译或降解靶mRNA的作用。Nathans等［10］研究表明 miR-29a能直接靶向HIV-1 nef基因，从而降低细胞内的病毒水平，而miR-198可抑制反式转录激活因子(transactivator of transcription，Tat)的辅助因子Cyclin T1，限制HIV-1对单核细胞的感染［11］。这些研究［9-11］均表明细胞内的天然miRNA对HIV-1的感染具有抑制作用，这也激起了很多研究者通过人工构建miRNA以发挥对HIV-1更强的抑制作用的兴趣。Liu等［12］构建的mir-17－92可使HIV-1的复制受到有效的抑制。Aagaard等［13］构建的三联mir106b簇人工miRNA经实验证明对HIV-1复制表现出更强的抑制作用。

siRNA是由外源性双链RNA(如病毒感染或人工插入)被细胞内Dicer酶切割而成的具有21～22个碱基对的小双链RNA分子。研究［14］表明，siRNA在抗病毒治疗方面非常有效，而且已研发了一些RNA干扰的治疗策略，来治疗遗传性疾病或传染性病原体。因为人们对HIV-1的生命周期和基因表达模式理解的比较多，所以HIV-1成为第1个被RNAi靶向的传染性病毒。在RNAi治疗中，由于能够产生特异抵抗的病毒株，因此选择合适的靶点很重要，目前已经通过实验证明比较有效的靶点包括HIV基因组的病毒颗粒蛋白表达调节因子(regulator of expression of virion proteins，Rev)、tat等基因［15］和宿主的核转录因子κB［16］(nuclear transcription factor κB，NF-κB)、CD4 受体、CC趋化因子受体5(CC chemokine receptor 5，CCR5)和CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)等，抑制这些分子的表达可以有效地抑制病毒复制和感染过程。但是，最近有研究［17］发现，HIV存在一种交叉抵抗机制，即当对某一种siRNA产生突变逃逸的同时，可以对另一种针对不同靶点的siRNA产生逃逸，目前具体机制仍然不清楚。这一发现为RNAi抗HIV治疗靶点的选择提出了更高的要求。鉴于宿主细胞基因产物在抗HIV RNAi治疗中不易产生突变逃逸的优点，目前，抗HIV新靶点的开发主要集中在与病毒复制相关的人类基因上。有些靶点已经被用于实验性抗HIV治疗，并取得了比较好的效果［18-19］。目前解决HIV-1突变逃逸的最好的方法是同时使用多个针对不同靶点的RNA干扰抑制剂［20］。Liu等［12］利用 mir-17 －92 多顺反子的骨架结构同时表达4个针对HIV-1不同位点的siRNA，使HIV-1的复制受到了有效的抑制。Ehsani等［21］依据miRNA作用于mRNA的3'端UTR区可以抑制靶基因翻译的原理，将HIV-1 3'端UTR的部分互补序列插入到针对gag-pol基因和HIV-1的辅助受体CCR5基因的siRNA序列中，结果这种具有双重功能的siRNA同时在转录和翻译水平抑制了基因的表达，并可避免病毒逃逸的产生。

为了防止RNA酶对siRNAs的降解，通常将siRNAs做成发夹状，即shRNAs，再用慢病毒载体等导入细胞内。已经有研究组［22］构建了能稳定下调CCR5表达的shRNAs，他们在体外实验中发现慢病毒载体投递针对CCR5的shRNAs能有效地降低细胞CCR5的表达，并赋予细胞对CCR5嗜性毒株的抗性。研究者［23］先前已经证明即使应用单一的shRNAs也会显著的抑制HIV-1，但是也观察到HIV-1在RNA干扰的压力下，通过其靶序列的突变而迅速逃逸。为了避免这个问题，针对HIV不同位点的多个有效的shRNAs组成的联合体就可以长期抑制HIV-1的复制，这种抗HIV-1的RNA干扰组合的基因疗法将进入临床试验［24］。有研究［25］显示shRNAs的表达是决定其毒性的关键因素。Kiem等［25］利用RNA聚合酶III启动子U6区过表达shRNAs可导致原始T淋巴细胞的细胞毒性，为了避免shRNAs细胞毒性，可以利用转录活性较弱的RNA聚合酶III的H1启动子来降低shRNAs的表达，同时选择一种强有力的靶向CCR5的shRNAs以保证能有效地下调CCR5的表达。这种优化的组合方法使体外人原始T淋巴细胞和源自CD34+细胞的巨噬细胞的CCR5受体降低了25倍，并且没有毒性作用［26］。

目前RNA干扰在基因治疗方面仍然有许多问题需要解决。由于机体固有免疫反应的激活和与内源性RNA的功能竞争，基于RNA的方法有潜在的脱靶毒性［27］及非特异性的免疫应答，如果长期应用可能干扰内源miRNA的功能［28］。

1.3 核酶

核酶是能酶促切割靶mRNA的反义RNA。按分子大小可分为大分子核酶和小分子核酶，大分子核酶由几百个核苷酸组成，结构复杂。小分子核酶仅含几十个核苷酸，其中包括锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒核酶以及链孢霉线粒体合成酶与核酶复合体［29］。目前已有很多研究证明以核酶为基础的用于治疗HIV感染的相关策略。使用一种丁型肝炎病毒来源的核酶靶向HIV-1的tat和rev序列，体外观测到靶mRNA被裂解，能使tat介导的反式激活水平降低62% ～86%［30］。提高核酶抗HIV-1效果的关键也是选择合适的靶点，Mitsuyasu等［31］设计了针对vpr和tat基因重叠区的核酶 OZI，该核酶可以有效抑制HIV-1的复制，同时在长期的细胞培养中核酶靶基因区的耐药位点并没有发生突变。此外，将核酶与靶RNA进行共定位也可以达到理想的抗HIV-1效果。Unwalla等［32］将核仁小 RNA(small nucleolus RNA，snoRNA)U16区中1～2个茎环随机插入锤头状核酶中，建立了一个锤头状核酶基因库，通过与含有HSVTK基因的前病毒DNA共转染HEK293细胞，最终筛选出一个与U5区和gag基因部分同源的核酶序列，该核酶可以与靶RNA共定位于细胞核，从而有效地抑制HIV-1复制。为了防止发生HIV-1病毒的突变逃逸，可设计针对HIV-1基因的多个靶点的核酶。研究者［33］针对人CCR5 mRNA的7个靶位点设计了多位点锤头状核酶Rz1－7，与单一锤头状核酶相比，该核酶对CCR5 mRNA表达水平的下调更为持久有效，几乎完全阻止了HIV-1对细胞的感染。DiGiusto等［34］用慢病毒载体将核酶导入由HIV-1感染者体内分离的自体CD34+细胞，然后将这些细胞再回输到患者(不管有没有进行骨髓预处理)体内去治疗艾滋病相关淋巴瘤，证明了用慢病毒－核酶载体进行基因改造细胞是安全的。

1.4 RNA诱饵

RNA诱饵作为一种外源性RNA，其序列与病毒复制过程中重要调节蛋白结合的顺式作用元件相似，通过竞争性地结合调节蛋白而起到抑制病毒复制的作用。以人免疫缺陷病毒tat蛋白的反式激活应答(transactivating response，TAR)元件为基础设计的TAR诱饵也可用于基因治疗。研究者［34］将TAR诱饵与针对HIV-1 tat/rev的短发夹RNA及靶向CCR5的核酶共表达于一个慢病毒载体(rockville，MD)，这种三重组合的载体已经获得美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于艾滋病或淋巴瘤患者自体外周血干细胞移植的临床试验。最近已经进行了I期临床试验测试了这种载体，可以显著抑制HIV-1的复制。

1.5 RNA适体

RNA适体是指体外筛选得到的能高亲和力地结合目标配体的单链寡聚核苷酸。尽管适体在抗HIV中展示出前景，但到目前为止，还没有应用抗HIV适体的临床试验，可能因为体外筛选的适体在细胞内也许不形成所需的三级结构来有效地结合靶蛋白。近年主要研究的是利用适体介导siRNA的细胞特异性传递［35］。

2 基于蛋白的抑制剂

多数的蛋白抑制剂是从病毒载体长末端重复序列中表达，但在一些情况下，它们是由插入病毒载体中的强大的启动子产生。

2.1 显性阴性突变体

显性阴性突变体是病毒蛋白的重要功能区出现突变。这种突变体蛋白可以和野生型病毒蛋白竞争结合靶位点，或与其形成多聚体，从而抑制正常病毒蛋白的功能。第1个用于抗HIV-1基因疗法临床试验的蛋白是艾滋病病毒Rev蛋白的突变体M10(Rev M10)。Rev M10蛋白通过阻断单个剪接和未剪接的艾滋病病毒RNA从细胞核到细胞质的输出，来阻止病毒颗粒的组装及随后的播散。目前这种突变蛋白仍然是一种最有效的抑制HIV复制的抑制剂。

2.2 细胞内抗体、细胞内趋化因子

细胞内抗体和细胞内趋化因子也是非常有效的HIV复制抑制剂。这些蛋白与病毒或细胞的靶蛋白结合，导致靶蛋白被蛋白酶降解。值得注意的是，这些靶蛋白包括HIV-1辅助受体CXCR4［36］。

2.3 融合抑制剂

融合抑制剂能够在细胞表面与HIV-1的gp41结合而阻止病毒进入细胞。这些阻断HIV进入细胞的蛋白可从反转录病毒或慢病毒载体链中表达，因而适合在基因治疗中应用。恩夫韦肽(FUZEON，罗氏)，俗称T20，通过抑制病毒包膜与细胞膜融合所需的构象改变来阻断HIV进入细胞，已于2003年被美国FDA批准用于临床实践［37］。但是为了克服对T20已经产生的耐药性以及改进T20的一些不足，如体内生物利用度低、使用不便(皮下注射，2次/d)、价格昂贵等因素，需要研发新的融合抑制。最近研究了1种新的融合抑制剂，称为C46，是由来自gp41的第2个七肽重复区的氨基酸组成，类似于T20，C46通过与HIV-1 gp41融合中间体的N末端卷曲螺旋核结合，阻止六螺旋体核心结构的形成，从而阻止HIV-1与细胞的融合。与其他基于蛋白的抑制剂一样，也能由反转录病毒载体表达并用于基因治疗［38］。最近的一份报告［39］证实，与 tat/rev特异的shRNAs和靶向HIV膜蛋白基因的长反义RNA(称为VRX496)相比，C46的抑制HIV-1感染的效果更强。C46的一种膜锚定形式(maC46)能赋予非人类灵长动物造血干细胞对HIV的抵抗性。值得注意的是，在体外及人源化小鼠体内接种HIV-1后，证明maC46赋予转导细胞选择性优势的能力最强。西夫韦肽(sifuvirtide)是我国自主研发的第3代HIV-1融合抑制剂，研究［40］结果显示，其具有显著的抗病毒效果，且对T20耐药毒株有很好的抑制效果，目前，该化合物已完成临床Ⅱb期研究。

2.4 锌指核酸酶

锌指核酸酶是一种人工设计、表达的融合蛋白，包含2个结构域:DNA结合锌指蛋白结构域和核酸内切酶结构域［41］，能专一性地结合特定基因组序列，然后其中的核酸酶内切割靶DNA。当这些双链切口修复的时候，就会在分裂部位发生高频缺失和插入。通过锌指核酸酶破坏CCR5基因的编码序列，会产生无功能的CCR5突变体，致使细胞对HIV的CCR5嗜性毒株具有抵抗性。在临床前研究中，Perez等［42］报道了用腺病毒载体投递针对CCR5氨基末端的基因编码序列的锌指核酸酶，导致人CD4+T细胞的CCR5等位基因破坏了50%。Holt等［43］将CCR5基因特异的锌指核酸酶导入由人脐带血和胎肝分离的CD34+细胞，结果CD34+细胞的CCR5等位基因破坏率大约为17%，他们估计有5%～7%的锌指核酸酶处理的细胞可能在2个等位基因上发生了突变。目前所面临的难题是，只能将锌指核酸酶蛋白或基因转录单位短暂地转导入细胞中，因为锌指核酸酶稳定表达可能引起基因毒性(来自染色体破坏，如易位)，而目标是在引起单一突变后，就从细胞中清除核酸酶。

总之，虽然基于蛋白的方法在体外有强大的抗病毒效应，但是不仅需要维持其足够的表达水平，而且要避免在体内的免疫原性，因为诱发的免疫反应会使其抗病毒活性丧失。因此，蛋白抑制剂进入临床试验中后，需要评估其效能和免疫原性。

3 目前基因疗法的应用策略

3.1 针对靶细胞受体

HIV-1与靶细胞的CD4受体及辅助受体CXCR4、CCR5结合是其感染细胞的早期步骤，因此通过上述基因疗法使这些受体的表达减少来抑制HIV-1的感染是近年来的研究方向。但是由于遗传研究［42-43］表明CD4的破坏会导致严重的免疫缺陷，而CXCR4受体是造血干细胞归巢和T细胞分化必不可少的受体，所以靶向这些受体可能不是一个可行的方法。相反，CCR5受体的破坏不影响免疫功能，具有CCR5受体32bp缺失的纯合子突变体的人更耐受HIV的CCR5嗜性毒株，所以CCR5辅助受体作为靶向目标，通过破坏CCR5来实现免疫系统抵抗HIV病毒的目的，这一方法将特别有前景，目前已经有很关于这方面的研究［21-22，26，42-43］。

3.2 联合策略

单一的抗HIV-1基因治疗可能导致病毒突变逃逸的发生，而且应用CCR5抑制剂治疗的病例可能出现CXCR4嗜性和双嗜性HIV-1毒株，因此联合多个抗HIV-1基因治疗的策略来抑制病毒生命周期的多个步骤以保护靶细胞是非常重要的［12，20-21，24，33］。通过这种方法，有研究组［44］已将多个抗HIV基因并入到一个单一的慢病毒载体。有研究［45］表明将针对CCR5的shRNAs、人类/恒河猴的嵌合TRIM5α(tripartite motif protein 5-alpha)和TAR诱饵共表达于一个慢病毒载体，这种抗病毒的三重组合在体外有效地抑制了来自CD34+细胞的巨噬细胞的HIV-1复制。这样的做法还有，将一种膜锚定的融合抑制剂C46和多个针对tat/rev的shRNAs被联合表达在一个慢病毒载体上［25］。尽管这些研究非常有前景，预计未来将会研发出更新的抗HIV-1基因制剂及更有效的组合方法。

4 抗HIV-1基因治疗中的基因转运方法

目前在抗HIV-1基因治疗研究中的基因投递方法很多，如病毒载体中的反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体等，非病毒载体中的免疫脂质体和穿透肽介导的抗体靶向传递方法［46-47］。随着纳米技术的发展，出现了更多的材料和方法，如利用明胶、壳聚糖等多聚物以及树状大分子、纳米粒子等非多聚物进行药物输送［48］。本文着重探讨近年来研究较多的慢病毒载体和抗体靶向传递。

4.1 慢病毒载体

由于慢病毒载体可以感染非分裂期的细胞，能够高效的整合到细胞的基因组中，并稳定传递到子细胞中长期表达，所以应用很广，而且已经有研究［49］证明第3代慢病毒载体用于人类是安全的，到目前为止还没有报道插入性肿瘤的发生。但是在HIV-1靶细胞—巨噬细胞和树突细胞中由于存在髓系来源的抗HIV-1 限制因子 SAMHD1［50-54］(sterile α motif domain and HD domain-containing protein 1)，所以对于慢病毒载体的转染不敏感。但猴免疾缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)及HIV-2来源的Vpx蛋白能够诱导SAMHD1降解来解除其抑制作用，据此原理，Bobadilla等［51］将一段 SIVmac/HIV-2来源的 Vpx序列引入慢病毒载体，显著提高了慢病毒载体对巨噬细胞和树突细胞的感染能力。

4.2 抗体介导的靶向传递

抗体通过与抗原结合后内化将siRNA靶向投递至靶细胞中。实验中常用的抗体包括抗CD7和淋巴细胞功能抗原-1(lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1)抗体等。但是能够介导内化的抗体并不容易制备，目前研究者常用穿透肽或免疫脂质体与抗体相连后介导抗体内化，并用于RNAi治疗中，取得不错的结果。Kumar等［52］将CD7单链抗体与穿透肽形成能够内化的融合抗体，然后连接针对HIV-1 vif、tat基因以及针对宿主细胞CCR5基因的siRNA并注入人源化HIV-1病毒血症的小鼠体内，结果有效地抑制了HIV-1的复制并且增加了CD4+T细胞数量。Kim等［53］将靶向LFA-1的免疫脂质体包裹CCR5 siRNA成为纳米颗粒，注射病毒血症的人源化小鼠能够有效地抑制病毒的扩增以及感染造成的CD4+T细胞减少。

5 结语

抗HIV-1的基因疗法有许多可选方案，转基因可以编码以RNA为基础的制剂，也可以编码以蛋白为基础的制剂。该领域面临的主要问题是抗HIV基因的靶向专一性、防止病毒抵抗性和这些制剂的潜在抗原性。鉴于在高效抗反转录病毒治疗中联合应用药物所取得的成功，最有意义的做法是，设计出抗病毒基因联合体共同表达于细胞的基因治疗策略。相对于仅仅靶向细胞或病毒基因，靶向CCR5和病毒基因的联合体有理论上的优势。鉴于现有的抗病毒基因的所有组成部分，这应该是未来基因治疗试验的目标。

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