组蛋白去乙酰化酶6在胃癌中的表达及意义

李光明，李能莲，张岭漪，王 亮，赵 睿

（1.兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030；2.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000）

组蛋白去乙酰化酶6在胃癌中的表达及意义

李光明1，李能莲2，张岭漪1，王 亮1，赵 睿1

（1.兰州大学第二医院，甘肃 兰州 730030；2.甘肃中医学院，甘肃 兰州 730000）

目的 了解组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）在胃癌组织中的表达及临床意义。方法 采用组织芯片与免疫组织化学SP法检测75例胃癌组织、15例癌旁正常组织和18例中-重度异型增生胃黏膜组织中HDAC6的表达情况，并分析其表达与胃癌临床病理特征的关系。结果 HDAC6在胃癌组织中的阳性表达率（52.0%）显著高于正常（0.0%）或中-重度异型增生组织（22.2%），差异具有显著性（P<0.05）；并且HDAC6在胃癌组织中的阳性表达率与肿瘤的浸润深度和淋巴结转移均具有相关性（P<0.05）。结论 HDAC6在胃癌组织中过表达，可能与胃癌的发生发展以及浸润和转移等恶性生物学行为密切相关。

组蛋白去乙酰化酶6；胃癌；免疫组织化学

肿瘤的发病机制十分复杂，近十余年来组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）在肿瘤发生中的作用成为研究热点。目前的研究多集中在Ⅰ类HDACs，认为其主要通过使核心组蛋白去乙酰化，导致染色质的空间构象由疏松型转为紧密型，从而引起某些肿瘤抑制基因转录抑制。研究[1~3]表明，组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）与肺癌、乳腺癌和口腔鳞癌等实体瘤的发生发展密切相关。但有关HDAC6与胃癌发生发展的关系，目前文献报道较少。本实验利用免疫组织化学法分别检测胃癌组织、癌旁正常组织和中-重度异型增生的胃黏膜组织中HDAC6的表达水平，并分析其与胃癌各临床病理特征之间的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

选取2012年10月至2013年10月兰州大学第二医院收治的术前未经过放、化疗的胃癌手术切除石蜡标本75例，正常对照标本15例（距癌组织5 cm以上），均为同批次手术的正常胃组织标本；中-重度异型增生18例，均为同年胃镜活检的组织。75例胃癌病例中，男性42例，女性33例；年龄31～76岁，平均55岁，≥55岁者45例，<55岁者30例；组织学分类：高分化腺癌16例，中分化腺癌26例，低分化腺癌33例（包括黏液腺癌7例，黏液细胞癌1例）；癌组织突破浆膜层21例，未突破浆膜层54例；有淋巴结转移29例，无淋巴结转移46例。

1.2 方法

1.2.1 组织芯片的制备 先制备模板蜡块，在模板上用组织陈列仪打出直径为2 mm的孔，然后镜下观察病理HE切片，对照相应蜡块选取典型肿瘤组织区域。在此区域获取2 mm的柱形组织，置于模板蜡块已打好的孔内，按号码顺序排列，表面压平，做二次包埋。常规石蜡切面，厚4 μm，进行免疫组化染色。

1.2.2 免疫组化染色 试剂采用鼠抗人单克隆抗体HDAC6（北京中杉公司），工作浓度为1∶100，SP9000通用型试剂盒和DAB显色剂（北京中杉公司）。具体操作按说明书染色步骤进行。抗原修复用微波修复。用PBS代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定

免疫组织化学检测结果：光镜下HDAC6表达主要定位于肿瘤细胞浆，以黄色、棕色、棕褐色颗粒为阳性表达。采用IP（Intensity Percentages）评分方法，综合染色强度和阳性细胞数两项指标进行判断。具体方法：（1）染色强度记分：细胞质无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；（2）阳性细胞数记分：0分为无阳性细胞，1分为阳性细胞≤10%，2分为11%<阳性细胞<50%，3分为51%<阳性细胞<75%，4分为阳性细胞＞75%。阳性强度为两项记分之和：0分者为阴性（-），1～2分者为弱阳性（+），3～5分者为中等强度阳性（++），6～7分者为强阳性（+++）。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件，所有资料比较采用χ2检验，以P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 HDAC6的表达

胃癌组织中HDAC6主要表达于癌细胞胞浆（见图1），其阳性细胞主要出现于肿瘤坏死区的周围以及浸润肿瘤的边缘（见图1）。75例胃癌标本中，有39例HDAC6阳性表达，阳性表达率为52.0%；肿瘤组织内浸润的淋巴细胞无着色。15例正常胃黏膜组织无HDAC6表达。18例中-重度异型增生胃黏膜组织中，有4例阳性表达，阳性表达率为22.2%，主要在增生腺体腺细胞胞浆（见图2）。HDAC6在胃癌组织和正常胃黏膜组织中的表达差异有显著性（χ2=13.765，P=0.000）；HDAC6在胃癌组织和中-重度异型增生胃黏膜组织中的表达差异有显著性（χ2= 5.178，P=0.025）。

2.2 HDAC6的表达与胃癌临床病理参数的关系

HDAC6的表达与肿瘤的浸润深度和淋巴结转移均相关，有显著性差异（P＜0.05），与患者年龄、性别、肿瘤分化程度之间无显著性差异（P＞0.05），见表1。

图1 HDAC6在胃癌组织中的表达（免疫组化SP法×400）

图2 HDAC6在癌旁组织中的表达（免疫组化SP法×200）

表1 HDAC6的表达与胃癌临床病理参数的关系

3 讨论

3.1 HDAC6在胃癌组织中高表达可促进胃癌的发生发展

在HDACs家族中，HDAC6是一个比较独特的组蛋白去乙酰化酶，具有核质穿梭功能，主要定位于细胞质[4]，分子量约为131.4 kDa[5]。研究表明，选择性HDAC6抑制剂与抗肿瘤药物紫杉醇联合作用，可协同抑制雌激素受体阳性乳腺癌细胞MCF-7的生长[6]。另有文献报道，HDAC6在肺癌组织[1]和乳腺癌组织[2]中的表达水平与肿瘤的预后呈负相关，在口腔鳞癌组织[3]中HDAC6呈上调表达并且与肿瘤的侵袭性明显相关。研究者还发现[7]，HDAC6过表达的小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）运动性比对照细胞强。HDAC6与胃癌发生发展之间的关系，目前文献报道较少。我们的研究表明，胃癌组织中HDAC6的表达水平显著高于正常或中-重度异型增生的胃黏膜组织，且穿透浆膜层的胃癌组织中HDAC6的表达水平也高于未穿透者，同时有淋巴结转移者HDAC6的表达水平明显高于无转移者。

3.2 HDAC6促进胃癌发生发展的机制可能与其调节HIF-1а、HSP90、细胞肌动蛋白及IIp45的生物学功能有关

HDAC6促进肿瘤发生发展及转移的机制目前尚不明了。研究表明[8~11]，HDAC6可增强缺氧诱导因子-1а（hypoxia-inducible factor1-а，HIF-1а）和热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）的生物学功能，可能是二者的上游调节因子。已知HIF-1а和HSP90可促进多种肿瘤（包括胃癌）的发生发展，是重要的致瘤因子。还有研究发现，HDAC6可通过调节细胞骨架肌动蛋白的功能进而促进细胞迁移[12]。另外，新发现的IIp45（aka MIIP）基因的蛋白质产物抑制细胞移动的功能可通过抑制HDAC6实现[13]。据此可以推测，本实验中HDAC6与胃癌发生发展以及浸润和转移等恶性生物学行为密切相关，其部分机制可能是通过增强HIF-1а、HSP90以及细胞肌动蛋白的生物学功能和抑制IIp45生物学功能实现的。

[1]Osada H，Tatematsu Y，Saito H，et al.Reduced expression of class II histone deacetylase genes is associated with poor prognosis in lung cancer patients[J].Int J Cancer，2004，112（1）：26-32.

[2]Zhang Z，Yamashita H，Toyama T，et al.HDAC6 Expression Is Correlated with Better Survival in Breast Cancer[J].Clinical Cancer Research，2004（10）：6962-6968.

[3]Sakuma T，Uzawa K，Onda T，et al.Aberrant expression of histone deacetylase 6 in oral squamous cell carcinoma[J].Int J Oncol，2006，29（1）：117-124.

[4]DE Ruijter A J，Van Gennip A H，Caron H N，et al.Histone deacetylases（HDACs）：characterization of the classical HDAC family[J].Biochem J，2003（370）：737-749.

[5]Voelter-Mahlknecht S，Mahlknecht U.Cloning and structural characterization of the human histone deacetylase 6 gene[J].Int J Mol Med，2003，12（1）：87-93.

[6]Itoh Y，Suzuki T，Kouketsu A，et al.Design，synthesis，structure-selectivity relationship，and effect on human cancer cells of a novel series of histone deacetylase 6-selective inhibitors[J].J Med Chem，2007，50（22）：5425-5438.

[7]Hubber C，Guardiola A，Shao R，et al.HDAC6 is a microtubule-associated deacetylase[J].Nature，2002，417（6887）：455-458.

[8]Kong X，Lin Z，Liang D，et al.Histone Deacetylase Inhibitors Induce VHL and Ubiquitin-Independent Proteasomal Degradation of Hypoxia-Inducible Factor-1а[J].MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY，2006，26（6）：2019-2028.

[9]Qian D Z，Kachhap S K，Collis S J，et al.Class II Histone Deacetylases Are Associated with VHL-Independent Regulation of Hypoxia-Inducible Factor-1a[J].Cancer Res，2006，66（17）：8814-8821.

[10]Aoyagi S，Archer T K.Modulating molecular chaperone Hsp90 functions through reversible acetylation[J].TRENDS in Cell Biology，2005，15（11）：565-567.

[11]Bali P，Pranpat M，Bradner J，et al.Inhibition of Histone Deacetylase 6 Acetylates and Disrupts the Chaperone Function of Heat Shock Protein 90[J].THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2005，280（29）：26729-26734.

[12]Close P，Creppe C，Gillard M，et al.The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear Proteins[J].Cell Mol Life Sci，2010（67）：1255-1264.

[13]Ying Wu，Sonya W，Song，et al.IIp45 Inhibits Cell Migration through Inhibition of HDAC6[J].THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，2010，285（6）：3554-3560.

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1671-1246（2014）13-0136-03