乙型肝炎病毒耐药突变基因检测在临床中的应用

许瑞元，王尔莉，曹霜，许玉慧，徐川林

(福建医科大学附属漳州市医院，福建 漳州 363000)

乙型肝炎(HBV)是危害人类身体健康最严重的常见传染病之一，我国是乙型肝炎的高发国家，人群中乙型肝炎表面抗原 (HbsAg)阳性率约为10.0%[1]。其中有2千多万为慢性乙型肝炎患者。近年来，随着核苷(酸)类似物的广泛应用，大部分病人的病情都能够得到控制，极大程度地改善了患者的生活质量[2]。但长期应用后，易出现耐药现象，成为当今乙肝治疗领域最大的挑战，研究表明，接受拉米夫定、阿德福韦酯联合治疗5年后，临床耐药发生率高，拉米夫定耐药发生率>60%，阿德福韦酯耐药发生率>20%[3]。本文对我院门诊2012年1月-2013年7月期间123例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定、阿德福韦酯联合治疗5年后，进行核苷(酸)类似物耐药基因检测，旨在发现HBV对不同的核苷类药物的耐药情况，为临床药物治疗提供理论支持。

1 资料与方法

1.1 一般材料 选取我院门诊2012年1月-2013年7月期间123例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定、阿德福韦酯联合治疗5年后的血清标本，男90例，女33例，年龄21~58岁，平均46.5岁。CHB诊断符合2005年《慢性乙型肝炎防治指南》[4]。

1.2 标本采集与处理 采集空腹受检者静脉血1ml，注入无菌1.5ml离心管中，于室温静置2h，转入 4℃静置 1h，8000r/min 离心 5min，吸取 200μl上清转入另一无菌1.5ml离心管中，置于4℃冰箱中待测。

1.3 仪器与试剂 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司提供的ABI310遗传分析仪，并使用其专用试剂。

1.4 检验方法 完全解冻试剂后充分混匀并3000r/min离心30s。用微量加样器在每一PCR反应管内分装20μlHBV PCR反应液。向上述分装好试剂的PCR管内，加入5μl样本DNA。将加有标准品、样本、对照品的PCR反应管按照预先设定好的程序依次置于PCR仪中，进行扩增。反应完毕，根据已知浓度标准品与扩增曲线Ct值之间的线性关系制作标准曲线，从而计算出待检标本血清中HBV病毒量。取5μl上述制得的PCR产物，再加入2.5μl SAP酶混合物震荡混匀，3000r/min离心30s，37℃60min,80℃15min，制得PCR酶解产物。取制得的PCR酶解产物3μl、测序试剂1μl和HBV测序引物2μl进行PCR扩增。最后，使用测序分析软件Chromas对相应耐药靶点进行结果分析。

2 结果

123 例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定、阿德福韦酯联合治疗5年后，进行核苷(酸)类似物耐药的检测。拉米夫定耐药84例，占68.29%；阿德福韦酯耐药25例，占20.32%；替比夫定耐药12例，占9.76%；恩替韦卡耐药2例，占1.63%。对不同核苷(酸)类似物有不同耐药发生率：依次是拉米夫定>阿德福韦酯>替比夫定>恩替韦卡。

3 讨论

我国有1亿多的乙型肝炎病毒携带者，其中有2千多万为慢性乙型肝炎患者，核苷(酸)类似物是临床上常用于慢性乙型肝炎抗病毒治疗的药物，它的应用极大地提高了慢性乙型肝炎抗病毒治疗水平。但是随着治疗时间的延长，核苷(酸)类似物会出现耐药。本研究123例慢性乙型肝炎患者接受拉米夫定、阿德福韦酯联合治疗5年后，拉米夫定耐药达68.29%，阿德福韦酯耐药20.32%，替比夫定耐药9.76%；恩替韦卡耐药1.63%，结果与国外研究一致。目前在我国批准用于乙肝治疗有四种核苷(酸)类似物即：拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替韦卡。我国目前常用拉米夫定、阿德福韦酯联合治疗慢性乙型肝炎患者。近年来，随着拉米夫定、阿德福韦酯长期应用后，易出现耐药现象。因此，核苷(酸)类似物耐药的检测及更加强效快速抗病毒药物的应用尤为重要。替比夫定、恩替韦卡近年来在我国上市，但也存在耐药现象[5]。我们的研究结果表明，HBV的耐药发生率依次为拉米夫定>阿德福韦酯>替比夫定>恩替韦卡，相对于拉米夫定，替比夫定和恩替韦卡属于强效快速抗病毒药物。对有抗病毒治疗适应证的患者，若选用核苷(酸)类似物应尽量选用抗病毒作用强、耐药变异发生率低的药物，同时要了解既往的治疗情况，包括核苷(酸)类似物应用情况、治疗应答情况及耐药变异情况，以便选择无交叉耐药的药物治疗。治疗期间应定期检测HBV的DNA水平。大量的临床试验数据表明，早期病毒学应答情况是预测耐药发生率的重要指标。所以加强对乙肝病毒耐药的检测，及时调整治疗方案，以提高疗效，降低耐药发生率是目前应对核苷(酸)耐药的最佳选择。

[1]罗超,任娟,高惠,等.乙肝病毒耐药导致慢性重型肝炎9例临床分析[J].西南国防医药,2010,16(5):4-6．

[2]张兆颖，拉米夫定临床研究进展[J].抗感染药学,2005,25(1):33．

[3]EASL Clinical Practice Guidelines.Management of chronic hepatitis B[J].Hepatology 2009,50(2):227-242.

[4]中华医学会肝病学分会、感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南[J].中华肝脏病杂志,2005,13(12):881-891．

[5]Yim H J，Hussain M，Liu Y,et al.Evolution ofmulti-drug resistant hepatitis B virus during sequential therapy[J].Hepatology,2006,44(3):703-712.