影响小鼠胚胎时期心脏发育的相关蛋白

蒋静综述，都莉审校

(南昌市第一医院检验科，江西 南昌330008)

小鼠胚胎发育中蛋白质随发育的阶段、特定的组织等变迁而不断发生变化，蕴藏着巨大动态的生命活动信息，利用蛋白质组学技术可从分子水平了解小鼠的发育调控、发育异常等的机制。心脏是胚胎发育的重要器官之一，并且内外环境的改变和高危因素都可能对心脏发育的威胁，其可最终导致多种临床疾病，尤其是先天性心脏病。心脏疾病是发病率与死亡率均较高的一种疾病，是世界上最常见的死亡原因之一，严重地威胁着人类健康。随着蛋白质组学技术发展，蛋白质组学技术已广泛应用于心脏疾病研究，如急性冠脉综合征、扩张型心肌病、先天性心脏病等[1-3]疾病。下面我们探讨了相关蛋白对小鼠胚胎时期心脏发育的作用。

心脏是小鼠胚胎发生过程中形成最早的器官之一，胚胎心脏发育经过原始心管的形成和复杂的形态发生最后形成四腔室结构的心，整个过程可人为地分为以下阶段：(1)生心细胞诱导和特化期(E7.5d)，起源于生心板；(2)心管形成、环化期(E8.5d～E9.5d)；(3)腔室特化和生长期 (E10.5d～E16.5d)；(4)心后期发育增大期(E16.5d～出生)[4]。 在心脏发育的整个过程中，需要一系列重要的形态发生事件，包括细胞决定、细胞迁移和细胞分化等[5]。小鼠生长发育的过程中其各种转录因子、转化因子、细胞骨架蛋白及细胞凋亡等众多基因及蛋白在不同时间上的顺序表达以保证胚胎心脏形成在时间和空间上的协调性。

1 转录因子对小鼠胚胎心脏发育的影响

心脏特异转录因子主要是指在心肌细胞中表达的关键转录活化因子，并且调控编码心肌细胞结构蛋白或调节蛋白的心脏基因的表达。单个转录因子并不能完全控制心脏的生长发育，而是由心脏特异及广泛表达的转录因子的特定组合，如锌指蛋白GATA4、同源域蛋白Nkx2.5和Thxs以及MADShox蛋白血清反应因子 (SRF)等综合作用，从而体现了不同的生理过程。

1.1 同源结构域蛋白转录因子

1.1 .1 Nkx2.5 Nkx2.5含同源结构域转录激活因子，同源结构域有一个螺旋一折叠一螺旋的模体，结合于保守DNA序列T(C/T)AAGTG。在小鼠胚胎7.5d时心脏CSX/Nkx2.5即开始表达，主要表达于心脏生成板内胚和中胚层、咽部中胚层和内脏中胚层等，是心脏最早特异性表达的转录因子之一[6]。传统的Nkx2.5基因敲除小鼠显示了早期胚胎致死和心管弯曲障碍，与已知的心脏同源盒基因在心脏发生早期的作用相吻合[7]。Nkx2.5缺失的小鼠心肌几乎不发育，心脏结构停滞在心管弯曲后的初始阶段。在Nkx2.5功能异常的小鼠胚胎心脏中，一些心脏基因表达降低，包括MLC2v，ANP，BNP，CARP，MEF2C，Ehand，N-myc，Ixr4 和 HOP[8]，Nkx2.5也参与了Pitx2的转录调控复合体上。

1.1 .2 Irx4(Iroquois homeobox gene4)Irx4属于含有同源结构域转录因子的Iroquois家族，为心室特异性同源盒基因，Irx4在整个发育阶段均在心室细胞特异表达。lrx4参与了肌球蛋白重链基因(MHC)在心室肌细胞特异表达的正调控和负调控。lrx4并不是心室特异性基因表达的全局调控因子，因为破坏小鼠的lrx4仅干扰部分心室特异性基因的表达，包括减少eHAND在胚心中的表达和出生后心房肽(AN)在心房中去阻遏。Irx4缺陷小鼠心功能减弱最终发展成心肌病，这强调了维持正常的腔室特异性基因表达对正常心功能的重要性[9，10]。

1.1 .3 pitx2 pitx2是成对同源域蛋白转录因子家族的成员，其主要功能是参与调控心房发育的不对称特征。缺乏pitx2的小鼠只有一个右心房形状的大心房，与下腔静脉及肺静脉连接异常。但最近研究显示：转录因子pitx2沿着早期心管的左侧表达，参与了介导从左到右的信号通路。从左到右传导缺陷的小鼠模型表现了缺失，双侧对称或者逆转的pitx2的表达[11]。

1.2 锌指蛋白转录因子

1.2 .1 GATA家族 GATA家族是一类锌指蛋自转录因子，具有结合核酸共同序列w/GATA/R的特性，进化上非常保守。GATA家族成员在调节细胞生长和分化方面起重要作用，目前有GATA4/5/6三个成员在心脏中表达[12]。GATA4/5/6在心肌分化过程中的表达暗示其可能与心内膜、心肌和大血管的形成有关。GATA4是心脏发育过程中的重要转录因子，是胚胎发育过程中心脏细胞的早期标志。小鼠胚胎在E7.0d～7.5d时，GATA4可以的中胚层祖细胞中最早检测到，心管的形成密切相关。GATA4缺失的小鼠胚胎内胚层细胞不能正常分化，腹侧迁移受阻，致心脏二分裂[13]，表明GATA4参与心脏中多种组分的发育。转录因子GATA4是心脏发生调节网络中重要的蛋白，调控间充质细胞向心肌细胞的分化增生及心脏的形态发生过程[14-16]。GATA5主要在心内膜细胞中表达，被认为是心脏形成途径中的看家调节因子，其与下游基因Nkx2.5一起促进许多成心脏基因表达。GATA5在Nkx2.5及其它心脏基因的表达、正常数量的心肌前体细胞的形成、心肌及心内膜形成、心室腔的分化等心脏发育方面，起到极其重要作用[17]。GATA6在中胚层表达，随后可在心肌及血管平滑肌细胞中表达，在早期发育阶段调节心肌前体细胞增殖。

1.2 .2 FOG-2 FOG-2为锌指蛋白转录因子与心脏间隔有关，小鼠缺失FOG-2不会引起细胞的增殖，而是出现类似于法乐氏四联症的房室间隔缺损并且伴随冠状血管形成障碍。在FOG-2缺失小鼠中强制表达FOG-2可弥补心脏和血管缺损，提示FOG-2在心脏内的靶分子可能是冠状血管形成的信号[18]。

1.3 Tbox转录因子

1.3 .1转录因子Tbox1 Tbox1转录因子在胚胎发育过程中，参与胚胎早期咽弓动脉的形成，神经嵴细胞的正确迁移和心脏流出道的形成Tbox1是调控心脏发育的主要的转录因子。Tbox1基因的突变或缺失会导致不同类型的心脏发育异常。

1.3 .2转录因子Tbox5 Tbox5最初在整个心脏中胚层都有表达，在前晚期线形心管形成期梯度表达，直到妊娠中期，只在心房和左心室表达[19]，对房室腔的初始分化和间隔的形成也具有重要作用，并且是手-心综合征的致病基因。在Tbox5缺陷的小鼠中的研究发现，其连接蛋白表达降低。它可能发挥双重作用：破坏发育中的传导系统正常的空间构型，破坏在传导系统的细胞自主效应。

1.3 .3转录因子Tbox18转录因子Tbox18是T-box家族的成员之一，是新的祖细胞标记因子，具有诱导多向分化潜能，对小鼠胚胎期多种器官的发育起重要作用，特别是对胚胎期心脏的发育作用尤为突出。有研究发现[20]：在E9.5d和E10.5d的小鼠胚胎含转录因子Tbox18的细胞最初在前体心外膜表达，逐渐向心外膜区域迁移；大于E11.5d的胚胎心脏也有明确而特异地Tbox18表达，表明转录因子Tbox18是小鼠胚胎前体心外膜的早期标志之一，对小鼠心脏的发育有重要作用。

1.4 其他转录因子 有研究表明，组蛋白乙酰化酶(p300)/CREB结合蛋白(CBP)对胚胎心发育有重要作用[21，22]；p300对整个胚胎心发育尤其是发育早期的生心细胞诱导特化和中期的室间隔形成作用更大。p300和CBP是转录共激活因子，在胚胎心发育过程中，它们通过调控胚胎心肌细胞增殖分化相关基因而起作用[23]。转录调控因子Pax基因表达的蛋白，它们在胚胎发育过程中对组织和器官的分化起着重要的调控作用，与心肌细胞凋亡有关。

胰岛素基因增强子结合蛋白l(Islet-1)是LIMHD蛋白中与心脏相关的亚型，是心肌祖细胞的标志之一。也是心脏发育核心转录因子中的关键因子。有报道指出[24]：转录因子Islet-1可以与p300结合，以蛋白复合物的形式存在，提示转录因子Islet-1可能作为枢纽因子募集HATs亚型p300，介导组蛋白乙酰化修饰对心脏发育相关基因GATA4、MEF2C和TBX5调控作用。

ISL-1是第二生心区主要的标志蛋白，在心管早期发育过程中，ISL-1和FGF、BMP、SHH等多种细胞信号及转录因子相互作用，调控第二生心区的发育、增生和细胞特异性的保持[25,26]。

有研究发现[27]：大鼠胚胎E15d，HCN4基因在蛋白水平及mRNA的变化在心房和心室均高表达，此后随胚胎心脏的发育逐渐下降，至P10d后接近成年低表达水平。提示HCN4在心脏不同发育阶段的作用不同[28]：胚胎HCN4是真正的起搏因子，成年小鼠HCN4通道的作用可能是参与普通心肌收缩与防止窦性传导阻滞。

2 转化生长因子对小鼠胚胎心脏发育的影响

转化生长因子β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)是一种具有多功能活性的生长因子。在胚胎发育期，TGF-β家族参与了早期心前体细胞特化，环状心形成，心内膜表皮向间充质转化，心外膜表皮向间充质转化等过程[29,30]。许多研究认为：TGFβs通过特异的丝氨酸/苏氨酸激酶受体介导发挥其生物学功能，在胚胎心脏发育过程中参与上皮一间充质转化、调节心肌特异性肌球蛋白的表达和心肌细胞的增生和分化[31]。转化生长因子TGFβs及其受体TβRⅠ和TβRⅡ是胚胎组织和器官发生的重要调节因子，可以促进发育中胚胎心脏心肌特异性蛋白质如：α-平滑肌肌动蛋白，α-肌节肌动蛋白，α-肌球蛋白重链和β-肌球蛋白重链的表达，在心内膜垫的形成和心脏的分隔过程中起重要诱导作用[32，33]。其中，α-SMA和结蛋白在小鼠胚胎心脏表达的时空差异性表明小鼠胚胎心脏不同部位发育成熟的时间有差异，右心室成熟较慢。α-SMA表达可能与早期胚胎心脏的缓慢蠕动收缩有关，而肌节的发育成熟需要较高的结蛋白表达[34]。

3 细胞骨架蛋白对小鼠胚胎心脏发育的影响

缝隙连接蛋白43(Connexin43，Cx43)是构成哺乳动物心脏缝隙连接最主要的连接蛋白，为心肌细胞问通讯提供代谢偶联和电偶联[35]。主要分布在工作心肌和周围传导系心肌，在维持工作心肌与周围传导系统的兴奋和传导等方面起重要作用。在胚胎E9.5d时，细胞缝隙连接蛋白Cx43在心脏中开始表达，对于心脏的正常形态发生起着极其重要的作用。对Cx43基因敲除小鼠研究表明，Cx43基因敲除纯合小鼠心脏发育畸形[36]，杂合小鼠心脏结构正常，但表现出心室心律失常。在人类，Cx43基冈突变与先天性心脏病密切相关[37]。

Nesprins(Nuclear envelop spectrin repeat)是细胞骨架蛋白家族的新成员，是英国剑桥大学医学系Dr.Zhang等用差异cDNA筛选和同源检索寻找血管平滑肌细胞分化标记物过程中发现，由两个基因编码的II型完整核膜蛋白[38-40]。Nesprin-1蛋白在心脏发育的各个时期均分布在核被膜和核周间隙，在心脏发育过程中Nesprin-1蛋白无迁移现象。推测核被膜蛋白Nesprin-1可能与胚胎心脏发育过程中传导系统发育以及收缩功能密切相关。Nesprin-2是Nesprins家族的一个蛋白亚型。研究发现14q23染色体异常可导致致心律失常性右室发育不良 (Arrhythmogenic right ventricular dysplasia，ARVD)[41，42]。 Nesprin-2 在 E12.5d 表达最高，随着心脏发育呈现逐渐下调的趋势，这一动态变化可能与心脏传导系统发育有关。

韧黏素(TN)是一种重要的细胞外基质糖蛋白，Imanaka-Yoshida等[43]研究表明TN-C在胚胎早期发育过程中的心肌细胞分化、原始心管扭转、心包腔形成房室间隔形成等过程中发挥重要作用。心脏胚胎时期发生发育主要受WNT[44]、骨形态发生蛋白 (bonemorphogenetic protein,BMP)[45]、Notch[46]等信号转导途径调控。BMP与Notch信号转导途径在胚胎心脏早期发生过程中起关键作用。其中，骨形态形成蛋白受体IA(bonemorphogenetic protein receptor IA,BMPR IA，又名ALK3)在心脏发育及心肌细胞的分化中起重要作用，并与室间隔缺损形成有关。

4 细胞凋亡对小鼠胚胎心脏发育的影响

细胞凋亡对于胚胎各器官的正常生长发育有重要作用，而凋亡异常是导致胚胎异常发育的重要因素。一旦发生凋亡紊乱将导致胚胎结构和功能的异常,甚至导致胚胎的死亡及心脏的异常发育。细胞凋亡是一个多步骤并且受基因调控的过程，其包含Bcl-2家族蛋白的调控和caspese的激活，丝氨酸蛋白酶也可能参与这一机制。有文献报道[47]：小鼠心脏的发育过程中：p53和Bax表达趋势具有一致性，在E11d~E13d表达较弱，表明此时心脏细胞可能主要处于增殖或者是分化时期。E14d时p53和Bax表达快速增加，达到高峰，且主要分布于心腔侧，结合HE染色组织学观察到此时为心脏体积迅速增大期，此时心在体积增大的同时也是心腔壁细胞大量凋亡、清除多余的细胞，使管腔体积不断增大的时期，为心脏的功能分化作准备，是心脏塑形关键时期。由此可见，细胞凋亡对心脏的正常发育也发挥一定的作用。

5 妊娠糖尿病对小鼠胚胎心脏发育的影响

糖尿病的孕妇子代畸形发生率很高，最常见之一是心脏畸形[48]。有研究表明[49]：高血糖组无论是外观正常还是畸形胚胎Pax3基因mRNA及蛋白质表达均显著降低，Cx43基因mRNA及蛋白质表达均显著升高，说明高血糖引起了Pax3及Cx43基因水平表达的改变，并引起蛋白质水平的改变，从而导致畸形的发生。

胚胎发育各器官蛋白质表达差异，使胚胎的器官结构和生理功能发生了一系列的变化，也更进一步说明了蛋白质与胚胎器官的发育是密切相关的，通过这些研究大大加深了人们对胚胎发育的认识。心脏发育是一复杂的过程，涉及许多蛋白质的参与。心脏疾病相关蛋白质的整体、动态、网络研究将直接从蛋白质水平来探讨心脏疾病发生过程中蛋白质种类和数量变化，从而阐明心脏疾病的发病机制，发现新的生物标志物，为心脏疾病治疗提供新手段和思路。同时，为我们了解人类心脏发育相关蛋白的研究提供了基础，这将有利于人类生殖健康，提高人口素质，进一步为人类的优生打下基础。

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