沈阳市部分市售酸奶乳酸菌的分离鉴定

李燚宸，刘德，陈晶，吴亚南，海晓欧

(1.沈阳医学院公共卫生学院2011 级预防医学专业2 班，辽宁 沈阳 110034;2.基础医学院病原生物学教研室)

酸奶被公认为是一种健康食品，因为其中含有对人体有益的乳酸菌而深受广大消费者的青睐。近年来，一些添加益生菌的酸奶及饮品通过改善人体肠道的微生态平衡而促进人体健康备受欢迎。目前我国批准在食品中使用的益生菌有10 种，主要是乳杆菌和双歧杆菌［1］。但是益生菌酸奶中的活菌必须达到一定数量才能在人体发挥功效。我国规定，酸奶中活菌的含量应达到1 ×106cfu/ml(g)以上［1］。欧美及日本等国则规定应达到l ×107cfu/ml (g)以上。为了调查沈阳市部分市售酸奶中添加的乳酸菌含量和种类，本研究对酸奶的菌种进行计数和分离鉴定。

1 材料与方法

1.1 酸奶及益生菌饮品 2013年10 月至11 月在沈阳市3个大型超市共选购4个厂家的11 种样品，其中有2 种为益生菌饮品，9 种为酸奶。6 种标注含有益生菌，其中3 种酸奶在标签上标明益生菌的数量。所有样品均在保质期内。

1.2 培养基 MRS 培养基、TPY 培养基(北京陆桥公司)。

1.3 仪器 生化培养箱(SHP-250，上海精宏仪器有限公司)、显微镜 (B41TF，日本OLYMPUS)、电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9626，上海精宏实验设备有限公司)、高压灭菌器 (HVE-50，日本HTRAYAMA)、自动菌落分析仪(HR2，杭州迅数科技有限公司)、厌氧培养箱(美国THERMO 公司1029 型)、医用超净工作台(苏州净化SW-CJ-FD 型)、ATB 细菌鉴定仪(法国梅里埃公司ATB new 型)。

1.4 方法

1.4.1 菌株分离培养 以无菌操作取25 ml 被检样品放入225 ml 灭菌生理盐水做成1∶10 的稀释液，取1∶10 的稀释液1 ml 装入9 ml 灭菌生理盐水的试管内，震荡试管混匀作1∶100 的稀释液。按照上述方法连续稀释倍数到10－9。分别取10－5～10－73个稀释度的样品稀释液0.5 ml 接种到MRS培养基内。将标明含有益生菌的产品取10－3～10－53个稀释度的样品接种在TPY 培养基。同时做生理盐水和空白对照。(36 ±1)℃厌氧培养，48～72 h 观察结果。

1.4.2 菌落计数 选取符合乳酸菌和益生菌的菌落特征、菌落数在30～300个之间的平板，按照GB/T 4789.35-2003 中检验程序规定进行菌落计数。通过菌落形态，挑取菌落进行革兰染色镜检，并做过氧化氢酶实验。镜检时看到革兰阳性无芽孢球菌或杆菌，过氧化氢酶实验阳性判定为乳酸菌［2］。

1.4.3 生化鉴定 选取符合乳酸菌特征的单个菌落，接种于MRS 和TPY 琼脂培养平皿中，(36 ±1)℃厌氧培养24～48 h 后，按照API50CHL 鉴定试剂盒说明进行生化鉴定。

2 结果

2.1 乳酸菌计数 本次调查的4个厂家的11 种产品，活菌计数范围为1.6 × 104～3 × 108cfu/ml(g)。其中9个样品的乳酸菌含量符合国家规定的标准1 ×106cfu/ml (g)，合格率达到81.8%。检测合格的其中3个样品乳酸菌的数量低于外包装标明的含量。

酸奶及益生菌饮品的活菌计数发现，普通酸奶活菌数符合国家标准的达到80%，而标明含有益生菌的酸奶及饮品中，活菌计数达到标准或与标签含量相符的仅为33.3%。

2.2 乳酸菌生化鉴定 本次实验的11个样品共分离出38个菌株，其中革兰阳性杆菌26 株，革兰阳性球菌12 株，过氧化氢酶实验全部阴性。

在检测的全部样品中，标识菌名与实际相符的达到72.7%。其中没有标明含有益生菌的普通酸奶菌株与实际相符达到100%，标签上标明益生菌的6个样品与标识的菌名相符的仅有3 种，合格率为50%。其中标明含有双歧杆菌的样品本次实验未被检出。

3 讨论

酸奶是国际组织推荐的六大健康饮品之一。人们通过食用酸奶可摄入大量乳酸菌和乳酸代谢产物，因为乳酸菌对其他有害菌有抑制其生长的作用，所以能够调节肠道微生态平衡。特别是含有益生菌的酸奶在如今市场上非常流行。益生菌对人体有多种益处，包括整肠作用、降低血压、改善血脂代谢、抗幽螺旋杆菌、防止虫牙、抗癌、特应性湿疹及皮肤炎的治疗及预防作用等。为了确保此类益生菌能在体内发挥正常的生理保健功能，一些世界性的食品组织已经提出标准，要求在发酵乳制品中双歧杆菌等益生菌的最低值为106～107cfu/ml (g)［3］。

本实验调查酸奶产品中活菌计数几乎都达到国家规定标准，但是含量差异较大。通过检测在产品标签上标明乳酸菌活菌数量的样品发现，其活菌数量低于其标明的数量。原因可能是产品在运输和储存的过程中未严格控制在低温环境，导致菌种活性降低;也可能是出厂时间较长，活性菌数量下降;或者是生产厂家并未添加足够数量的活菌数。

通过检测发现，普通酸奶中添加的菌种数量和种类绝大多数符合国家规定标准。但是标明含有益生菌的酸奶及饮品的益生菌菌种与产品标识相符的仅为50%，活菌数量达到国家标准或与产品标明的数量相符的仅为33.3%。在标识含有双歧杆菌的酸奶中没有检测出双歧杆菌。其原因可能是:(1)益生菌对生长条件的要求较为苛刻，在培养过程中乳酸杆菌和嗜热链球菌成为优势菌群，导致未被检出。(2)生产厂家没有添加此种细菌。(3)在产品储存和运输的过程中没有控制在低温环境，导致乳酸菌大量繁殖，益生菌死亡而未被检出。

益生菌饮品的营养作用和保健功能主要决定于其成品中含有活菌的数量，生产单位应该重视产品的质量控制。添加的菌种种类和数量应符合国家规定的标准，达到营养保健的功能。

［1］中华人民共和国卫生部.GB 4789.35-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验 乳酸菌检验［S］.北京:中国标准出版社，2010.

［2］朱小红，顾瑞霞.益生菌冰淇淋的开发［J］.食品工业科技，2006，(11):199－205.

［3］董银苹，崔生辉，李凤琴，等.北京市售酸奶中益生菌的分离鉴定及耐药性检测［J］.卫生研究，2010，39 (5):552－555.

［4］Bibiloni R，Zavaglia A G，AntoniG D.Enzyme-based most probable number method for the enumeration of Bifidobacterium in dairy products［J］.J Food Prot，2001，64 (12):2001－2006.