人神经生长因子重组慢病毒载体构建及检测

张飞，吴建红，杜义恒，刘海涛，夏术阶

·论著·

人神经生长因子重组慢病毒载体构建及检测

张飞，吴建红，杜义恒，刘海涛，夏术阶

目的：构建含神经生长因子（NGF）基因的重组慢病毒载体，并在293T细胞中验证NGF是否可以过表达。方法：将NGF基因克隆至慢病毒穿梭质粒Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，然后利用酶切鉴定、PCR鉴定及测序验证后，同两个辅助质粒共转染到293T细胞中，构建重组慢病毒载体。重组慢病毒感染293T细胞，通过荧光检测慢病毒的转染效果，用Western Blot检测NGF基因的表达。结果：酶切鉴定、PCR扩增鉴定和对重组慢病毒进行测序，提示重组慢病毒构建正确。荧光显微镜观察重组慢病毒感染的293T细胞，可见强荧光。Western Blot结果提示目的基因可正常表达。RT-PCR测得病毒滴度达到可利用标准。结论：人NGF重组慢病毒载体构建成功。

神经生长因子；慢病毒载体；糖尿病神经源性膀胱

神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是目前发现最早、研究最为透彻、应用最广泛的神经营养因子。NGF对神经元的存活、生长发育、分化、再生和功能维持起着调控作用[1]。最近研究发现，在糖尿病神经源性膀胱（diabetic neurogenic bladder，DNB）动物模型中，交感神经支配的靶器官NGF含量明显减少，这提示NGF减少可能跟DNB的发生发展存在一定的关系[2,3]。笔者的前期研究亦发现NGF在糖尿病大鼠膀胱和骶髓背根神经节中低表达，在糖尿病膀胱病变中发挥重要作用[4]。本实验成功构建NGF重组慢病毒，其表达也在293T细胞中得到验证，为进一步研究NGF与DNB发生发展之间的关系以及采用外源NGF治疗DNB奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.2 试剂与器械 1 kb DNA ladder Marker（购于立陶宛Fermentas公司)；250 bp DNA ladder Marker（购于上海捷瑞公司）；In-FusionTMPCR Cloning Kit（购于美国Clontech公司)；聚合酶（购于上海欣百诺公司）；限制性内切酶（购于美国NEB公司）；质粒抽提盒（购于美国Promega公司）；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（购于北京天根生化公司）；胎牛血清、DMEM（购于美国Gibco公司）；Opti-MEM、Lipofectamine 2000（购于美国Invitrogen公司）；蛋白检测试剂盒（购于美国HyClone-Pierce公司）；Prestained protein marker（购于上海中晶公司）；ECL-PLUS/Kit（购于英国Amersham公司）；PCR仪 （购于美国Applied Biosystems公司）；生物安全柜（购于新加坡ESCO公司）；空载体病毒（购于上海吉凯生物科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 NGF重组慢病毒质粒的构建和检验 慢病毒载体GV287原件顺序为：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP，克隆位点为AgeⅠ。设计合成PCR引物：上游引物 5'-G AG G A T C C C G G G TA C C G G T CGCCACCATGTCCATGTTGTTCTACAC-3'和下游引物 5'-T CC T T G T A G TC C A T ACCGGCTCTTCTCACAGCCTTC-3'，利用PCR方法钓取NGF基因。将GV287慢病毒质粒进行酶切，酶切产物电泳后回收。PCR产物NGF基因交换入线性化GV287慢病毒质粒，定向克隆连接成为NGF重组慢病毒质粒。用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌DH5α感受态细胞。NGF重组慢病毒质粒转化感受态细胞。对转化后长出的阳性克隆进行PCR及测序鉴定。

1.2.2 NGF重组满病毒的包装 将处于对数生长期的293T细胞悬液接种于24孔板中，接种密度为6×105细胞/mL，37℃、5%培养箱培养至细胞融合80%，制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒GV287及两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0、pHelper2.0，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素提取，按Lipofectamine 2000使用说明进行共转染293T细胞，转染后8 h更换为完全培养基。

1.2.3 NGF重组慢病毒的功能检测 待共转染293T细胞24 h后，在荧光显微镜下观察荧光标记基因的表达情况，判断感染效率（图1），荧光拍照后补加500 μL完全培养基，转染36 h后，收集细胞进行Western Bolt，检测NGF的表达情况。

1.2.4 NGF重组慢病毒质粒的收获、浓缩、滴度测定 培养48 h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩得到高滴度的慢病毒浓缩液。将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，于－80℃长期保存。取出一支用实时定量PCR法测定并标定病毒滴度。

1.2.5 介导NGF慢病毒转染脐带间充质干细胞 将处于对数生长期的脐带间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）悬液接种于的24孔板中，接种密度为4× 105细胞/mL，37℃、5%培养箱培养至细胞融合50%，分别以感染复数（multiplicity of infection，MOI）5、50、100的慢病毒转染脐带MSCs，24 h后更换新鲜培养基，72 h后荧光拍照，找到转染最佳MOI。按照最佳MOI，依完全空白对照、空载体对照、重组慢病毒转染脐带MSCs，然后大规模培养扩增。

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2 结果

2.1 目的载体酶切结果

慢病毒载体经酶切、电泳，获得大小均为10 kb的载体片段（图2）。

2.2 重组慢病毒测序及PCR扩增鉴定

对NGF重组慢病毒质粒进行基因测序，序列正确（图3A）。以重组慢病毒质粒为模板，特异的NGF引物进行PCR反应，获得大小为767 bp的目的基因（图3B）。

2.3 目的质粒感染293T效果及Western Blot检测NGF基因表达

用NGF重组慢病毒质粒感染24孔板中的293T细胞，转染后细胞进行荧光观察（图1），荧光表达强。这表明目的质粒转染正常、目的质粒荧光标记基因表达正常。Western Blot检测NGF基因表达（图4），目的基因融合蛋白大小为29 kD，可观察到29 kD附近处有特征条带，其大小和目的基因融合蛋白相吻合，该质粒用FLAG抗体检测到目的条带，表明质粒中的NGF可正常表达。

2.4 病毒滴定测试

实时定量PCR测量病毒滴度，绘制出Real time PCR曲线图（图5）。样本滴度计算：1/(1.00E-04)×20＝ 2.00E+5 TU/μL=2.00E+8 TU/mL，滴度值＞2.00E+7 TU/mL。

2.5 慢病毒转染脐带MSCs

在MOI为100时，转染效率达到80%以上，认为是一个最佳转染MOI（图6）。

3 讨论

DNB是糖尿病的泌尿系统常见并发症，发病率约为25%~85%[5]。DNB早期症状隐匿，随病情发展出现多种泌尿系症状：尿动力学改变、肾盂积水、肾盂肾炎、败血症等，最终发展为尿毒症[6]。目前临床常用的治疗DNB的方法包括控制血糖水平、抗感染治疗、滴注酚妥拉明、肌注B族维生素、营养支持等，传统的中医包括中药内服、针灸亦有一定的疗效。症状过重或对药物治疗不敏感的患者，考虑行外科手术治疗，其中肠道膀胱扩大术疗效尚可[7]。以上治疗方法大都缺乏针对性，无法对糖尿病引起的外周神经损伤进行修复，只能暂缓症状，不能中止DNB的进展，亟待寻求治疗效果更好的方法。

目前，DNB的发病机制尚未完全清楚，Hellweg等[8]发现在糖尿病大鼠交感神经支配的靶器官中NGF含量较正常大鼠减少50%以上，而神经末梢分泌的NGF能逆向轴突转运至神经元和细胞体中发挥生物学效应，由此推测内生NGF分泌减少是诱发DNB的主要致病因素。Goins等[9]利用单纯疱疹病毒介导外源性NGF增加周围神经元内NGF的表达，取得了良好效果，通过增加神经支配靶器官中NGF含量修复受损神经达到治疗目的，为临床治疗DNB提供了新思路。

MSCs是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，在1966年首先由Friedenstein等[10]从骨髓中发现。MSCs免疫原性低且下调免疫应答，是理想的组织工程细胞和基因治疗的载体细胞[11]。其中脐带MSCs取材简便、来源丰富、扩增和分化能力强，具有良好的利用前景。国内外学者采用重组慢病毒载体介导不同外源基因转染至MSCs中，并获得持续稳定的表达[12]。MSCs在体外可定向诱导分化为神经上皮祖细胞，而后进一步分化为神经元和神经胶质细胞，可作为神经组织损伤修复的工程细胞[13]。利用介导NGF的慢病毒转染脐带MSCs，然后将过表达NGF的脐带MSCs诱导成神经上皮祖细胞，联合NGF和神经上皮祖细胞的基因治疗、细胞治疗作用，以期待对神经损伤更高效的修复。本研究成功构建NGF重组慢病毒质粒，确定慢病毒转染脐带MSCs的最佳MOI，为后续获得过表达NGF神经上皮祖细胞稳定株并进一步研究NGF和DNB关系、论证过表达NGF的神经上皮祖细胞治疗DNB的可行性奠定基础。

[1]贾彩霞,王元松,田凤胜.神经生长因子与糖尿病神经病变的研究进展 [J].医学综述, 2012,18:3256-3259.

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[3]Li Y,Shi B,Wang D,et al.Nerve growth factor and substance P:expression in a rat model of diabetic bladder[J].Int Urol Nephrol,2011, 43:109-116.

[4]吴建红,邵怡,刘海涛,等.糖尿病大鼠膀胱和骶髓背根神经节中NGF的表达与尿流动力学改变的研究[J].现代生物医学进展,2011,11: 824-826.

[5]Daneshgari F,Liu G,Birder L,et al.Diabetic bladder dysfunction:current translational knowledge[J].J Urol,2009,182:S18-S26.

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[7]张帆,廖利民,付光,等.肠道膀胱扩大术治疗神经源性膀胱77例疗效观察 [J].中华泌尿外科杂志,2012,33:655-659.

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（本文编辑：王晶）

Construction and Identification of Lentiviral Vector Carrying Nerve Growth Factor Gene

Objective:To construct the recombinant lentiviral vector containing nerve growth factor(NGF)gene and test the overexpression of NGF gene in 293T cells.Methods:The NGF gene was cloned into lentiviral shuttle plasmid(Ubi-MCS-3FLAG and-SV40-EGFP),and identified by the enzyme cut assay,PCR and gene sequencing.It was then transfected into 293T cells to construct the recombinant lentiviral vector plasmid.The infection efficiency of lentivrius transfection was detected by fluorescence microscope and the protein expression of NGF was tested by Western blot.Results:The construction of lentiviral vector carrying NGF gene was correct which was verified by the enzyme cut assay,PCR and gene sequencing.Strong fluorescence was observed in 293T cells after lentiviral vectors transfection.Western Blot analysis showed a characteristic band of NGF.Conclusion: Recombinant lentiviral vector carrying NGF gene was constructed successfully.

nerve growth factor;lentiviral vector;diabetic neurogenic bladder

R741；R694+.5

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.05.001

上海交通大学附属第一人民医院泌尿外科上海200080

国家自然科学基金（No.81170701）

2013-11-01

刘海涛doctorlht69@163. com