结核病兔模型的建立应用及其研究现状

柯常江，冯起校，李富浩

(中山市陈星海医院广东医学院附属中山医院呼吸内科，广东中山 528415)

·综述·

结核病兔模型的建立应用及其研究现状

柯常江，冯起校，李富浩

(中山市陈星海医院广东医学院附属中山医院呼吸内科，广东中山 528415)

结核病的发病人数之多、流行范围之广、致死率之高，是当今世界传染病预防治疗的难题之一。复制出人类结核病的动物模型已经成为研究结核病的重要工具。为了解结核病兔模型研究概况，本文对结核病兔模型动物品种品系的选择、造模方法、应用范围等做一简要分析。

感染；动物模型；结核病；综述

根据世界卫生组织流行病学调查表明，世界上约三分之一的人口曾不同程度感染上结核分枝杆菌，其中百分之十左右发展成为结核病，全球感染患者人数每年超过800万，其中死于结核病约300万人左右；结核病已成为当今世界由一种病原菌引起的疾病当中死亡患者最多的传染病之一，我国约有超过100万结核病患者，位居世界第二位，是全球结核病高发病率的国家之一[1]。因此，建立一个合理的动物模型对于深入研究结核病病因、机制、病理过程、机体免疫反应、诊断、药物治疗及新疫苗开发等具有重要的意义。本文对结核病兔模型动物品种品系选择、感染途径、感染方法、感染剂量、菌株毒力及其应用范围做一简要概述。

1 实验兔的品种及品系的选择

选择实验动物模型兔子品种及品系在实验研究当中非常重要。目前我国常用的品种主要有中国白兔、青紫兰兔、日本大耳白兔、新西兰白兔等，其中新西兰白兔最为常用。2004年Dorman等[2]发现通过气溶胶途径用H37Rv或Erdman株结核杆菌分别对新西兰白兔远交系和近交系进行感染并比较。感染后第5周，近交系兔子比远交系兔子出现更大的肺结核病灶。用人型结核分枝杆菌H37Rv菌株感染后，近交系兔子比远交系兔子出现更多的肺结核病灶并且每个病灶当中结核分枝杆菌的集落形成单位也明显较多。比较二者的组织学，近交系兔子出现更多的干酪样坏死及活菌数量，但上皮细胞却极少。因此，表明近交系兔子比远交系兔子对结核分枝杆菌更加敏感。在2005年Gupta等[3]利用该模型比较近交兔子与远交兔子对结核分枝杆菌的敏感性和抗性发现两者存在较大的不同：远交兔子对结核分枝杆菌的敏感性和抗性存在明显的个体差异，而近交兔子难以获得。

2 常见结核病兔模型

2.1 肺结核兔模型1996年，Converse等[4]成功制作出空洞型肺结核兔模型，第一次描述并分析了肺结核空洞形成的完整过程。利用两个不同剂量组的牛型结核分枝杆菌菌株通过气溶胶途径感染新西兰白兔，分别吸入220～880个分枝杆菌单位和吸入3 900～5 800个分枝杆菌单位，两组均可以发展成为结核典型病灶，如液化坏死和肺结核空洞。肺结核空洞最早出现在感染后第6周，在第33周肺部病变仍有液化及干酪坏死，其外周有大量纤维包裹。笔者还发现组织蛋白酶D在干酪样坏死、液化及空洞形成的过程中起着重要的作用。2009年，Nedeltchev等[5]使用103～104CFU/0.3 ml剂量的结核分枝杆菌CDC1551、牛分枝杆菌AF2122、BCG和结核分枝杆菌H37Rv通过支气管镜接种于致敏的新西兰白兔右肺基底段。感染后6～15周均可以产生明显的结核空洞。牛分枝杆菌AF2122感染兔子的肺空洞液化组织可培养出杆菌数最高在106～109CFU，而其他三组介于104～108CFU之间。所有的动物都可发生肺部结核结节样病变，但牛分枝杆菌AF2122感染引起的结核结节样病理改变及肺外播散最为明显。这种独特空洞模型为结核空洞的发病机制及肺外播散研究提供了基础。2011年，Subbian等[6]使用结核分枝杆菌HN878菌珠通过气溶胶途径感染新西兰白兔，动物肺部出现一系列结核病理过程，如干酪样坏死、液化及肺部组织能培养出结核杆菌，从而成功制作出肺结核模型，通过此模型用于研究磷酸二酯酶-4抑制剂CC-3052联合异烟肼可以提高肺结核的治疗效果。

2.2 结核病潜伏期兔模型Manabe等[7-8]使用104～106CFU剂量人型结核分枝杆菌H37Rv标准菌株通过气溶胶途径感染新西兰白兔，感染后第5周所有兔子肺部组织的带菌量可达到峰值，右上肺叶匀浆培养结核分枝杆菌量可达到2.07×103～2.8×104CFU，而且第36周1/3的兔子体内仍有至少1个带活菌的干酪样肉芽肿。若感染后第5周进行糖皮质激素免疫抑制，通过观察发现结核菌素实验反应、肺部干酪样结节及结核杆菌数量增加、CD4+及CD8+T细胞减少，这样可使结核分枝杆菌被重新激活，其中发展成为免疫重建炎症综合征兔模型的比例高达50%。此模型属于结核病潜伏期模型，可用于研究免疫发病机制及提高疾病各阶段的诊断将具有重要作用。Subbian等[9-10]通过气溶胶途径将(1.08±0.31)×103CFU结核分枝杆菌CDC1551感染新西兰白兔，在感染后第4周感染兔子的肺匀浆培养结核分枝杆菌量达到峰值(3.0±1.3)×105CFU，以后持续下降至第24周时肺匀浆培养全为阴性。如果使用糖皮质激素可以诱导结核复发，肺匀浆培养结核分枝杆菌再次出现阳性并持续升高一段时间。这表明肺部组织内仍有极少部分结核分枝杆菌呈现出潜伏状态，当免疫力抑制时可以重新激活。这种自发潜伏性结核病模型为结核病分子免疫机制研究奠定了基础。

2.3 结核分枝杆菌所致家兔皮肤液化病理模型Zhang等[11]在新西兰白兔皮内分别注射5× 102CFU/ml、5×104CFU/ml、5×106CFU/ml耻垢分枝杆菌菌液、H37Ra和BCG，第6周在病灶周围第二次皮内注射相同剂量，第8周在明显病灶处做病理组织检查，最明显的脓肿液化、坏死、破溃等病理改变出现在5×106CFU/ml剂量组。BCG引起结核病变最为严重，病变最轻的是耻垢分枝杆菌。典型的结核性肉芽肿可以在显微镜下观察到。在结核病灶处的细菌抗酸染色当中所有动物兔子检测结果都呈阳性。再次免疫后中、低剂量组的BCG不引起液化坏死溃疡，但可以出现较轻的炎症反应和较小结核结节，其余低、中剂量组未见到明显结核病理改变。结核分枝杆菌皮内注射家兔皮肤模型，可用于结核性肉芽形成、继而发生液化坏死、药物筛选和新疫苗开发等方面的研究。此模型操作简单、快速、直观、成本较低，还有利于家兔使用范围的推广。

2.4 骨关节结核兔模型刘正文等[12]先将明胶海绵吸附结核分枝杆菌H37Rv菌株悬液(0.5 mg/0.1 ml)，再将其填充在无致敏新西兰白兔L5上方的椎间盘处钻骨孔内。结核菌感染后发现，兔子全身反应较轻，局部反应较明显。感染组12只兔子中9只顺利完成实验，3只出现纳差和消瘦；术后1个月有2只兔子出现X线阳性，术后2个月有4只兔子X线阳性，术后2个月有7只兔子MRI阳性，术后2个月6只兔子CT阳性。对感染组阳性兔子的椎旁软组织及椎体做病理切片可以观察到有类上皮样细胞、脓细胞及坏死病灶等形成，感染组阳性兔子病灶明显处取脓液做细菌培养显示60.0%结核分枝杆菌生长。根据术后2个月6只兔子CT阳性推算出建立此模型有66.7%的成功率。因此，将合适剂量和浓度的结核分枝杆菌H37Rv菌株种植在未致敏的新西兰白兔脊柱椎体局部，制作出兔脊柱结核动物模型的病理变化与人类脊柱结核非常相似。此模型尽管手术建立的脊柱结核动物模型，在发病机制上与人类脊柱结核尚有一定差异，但仍为目前较为可行的应用于脊柱结核相关研究的实验载体。对于早期诊断脊柱结核有些学者利用脊柱结核动物模型进行分析磁共振弥散加权成像(DWI)及测量AD值可以获得一定信息[13]。李万里等[14]使用l×107CFU/ml H37Rv结核杆菌悬液0.2 ml对新西兰白兔膝关节囊进行注射感染。第4周发现，家兔膝关节逐渐肿胀；X线摄片检查显示膝关节囊有肿胀；磁共振检查显示关节周围软组织肿胀，关节腔积液；病理检查可见结核病灶；滑膜组织培养有结核杆菌生长；说明已成功制作出新西兰白兔膝关节滑膜结核模型。此种模型构建的方法简单，成功率高，重复性强，组内病变程度较一致，为膝关节结核的病理学及药效学的动物实验研究奠定了一定基础。2002年，吴启秋等[15]在家兔膝关节腔注入0.5 mg/0.1 ml牛型分支杆菌，成功建立兔膝关节结核模型。毕龙等[16]在实验前对大耳白兔进行结核菌素纯化蛋白(PPD)试验阴性作为模型动物，再皮内注射1 ml BCG使动物致敏，然后对已经在动物股骨内髁松质骨内造好的隧道内注射大剂量结核因子(包括完全佛氏佐剂0.5 ml、皮内注射用卡介苗0.5 ml、300 μg/ml Mt Sonicate 0.5 ml)，由此引起迟发型超敏反应(DTH)及骨质破坏，可以从动物大体变化、病理组织学、放射学(X线片)来观察免疫性骨结核模型的变化。可以明显的观察到，结核因子注射部位出现骨髓腔内的破骨细胞增殖、骨吸收破坏、大量单核巨噬细胞浸润及干酪样坏死。因此根据骨关节结核发病过程成功的制作出兔免疫性骨结核模型。此模型能替代活结核杆菌建立的动物模型并且可以模拟骨结核的病理特点。本模型构建的方法简单，重复性强，成功率高。

2.5 结核性脑膜炎兔模型2007年Tsenova等[17]利用新西兰白兔成功的制作出结核性脑膜炎模型。方法：在动物麻醉后，通过脊髓穿刺针进入小脑延髓池注入5×105CFU结核分枝杆菌H37Rv或HN878，通过脑脊液检测培养出结核分枝杆菌、中枢神经系统体征及大脑组织病理学观察都出现结核样改变，通过此模型来研究BCG对结核分枝杆菌H37Rv及HN878免疫保护效能评估。结果发现，BCG对H37Rv及HN878感染都有免疫保护力，但对H37Rv感染免疫保护力最强。虽然BCG具有免疫保护力，但却不能阻止兔子体重减轻，也不能阻止大脑和肺脏病变及症状的出现，同时也阻止不了结核杆菌向肝脏、脾脏、肾脏扩散。因此研究者建议，当运用动物模型来检验新疫苗的保护力时，不仅要用H37Rv标准菌株，同时还要用不同临床分离菌株比如北京株。他们利用此模型，进行评估重组融合聚Mtb72F加AS02A、BCG(卡介苗)及重组融合聚Mtb72F加AS01B三者之间的免疫保护作用。最后得出结论：免疫力保护功效程度依次为重组融合聚Mtb72F加AS01B增强于重组融合聚Mtb72F加AS02A，后者又强于BCG[18]。因此，可以用于结核疫苗方面的研究。同时他们还利用结核性脑膜炎兔模型，表明了结核分枝杆菌H37Rv与结核分枝杆菌HN878和W4（W北京基因型）相比菌株毒力较弱[19]。

2.6 其他类型及应用Jassal等[20]通过支气管镜途径将103～104CFU牛分枝杆菌分别感染致敏和末致敏的新西兰白兔，对照观察兔子体重、结核菌素试验、肺部CFU数、肺部及肝脾肾的病理变化（如结核结节的数量）等，进一步对评价结核性兔模型大体病理评分系统(Gross scoring system)制定与完善。杨奇等[21]实验动物选用日本大耳白兔，一组经动物耳静脉直接注射107/1 ml H37Rv菌悬液，一组动物免疫器官功能被钴-60辐射破坏后耳静脉注射H37Rv菌悬液(107/ml)。3周后处死动物，内脏器官做病理组织切片经BCG免疫组织化学染色、MCT(三色)染色、HE染色、Z-N染色及电镜观察。结果显示，动物心肌和冠状动脉均可以观察明显结核病变，而且免疫功能低下动物易于感染结核并较为严重。本实验以家兔作为动物模型来探讨结核杆菌能否导致冠状动脉的病理性损伤。

3 结语

肺结核兔模型为结核空洞的发病机制、病理形成过程、肺外播散及药物治疗提供研究基础。结核病潜伏期兔模型对于研究免疫发病机制、结核病阶段性诊断、药物抗持留结核分枝杆菌的功效上有着比较重要的作用。皮肤结核兔模型对于模拟人肺部的干酪样坏死和液化，比较不同结核分枝杆菌的毒力、药物筛选和新疫苗开发等方面的研究具有一定的优势。骨关节结核兔模型对研究骨关节结核的发病机制、病理学及治疗疗效等奠定了一定基础。结核性脑膜炎兔模型是一个非常有用的工具，对评估菌株毒力、疾病进展和病理以及测试新的候选疫苗疗效也具有明显的作用。一个好的疾病动物模型应具有：(1)生命周期能够满足实验需要，并且动物遗传背景资料完整；(2)再现性好，也就是可以模拟人类的疾病；(3)专一性强；(4)复制率高。根据结核病的研究内容不同，需要综合考虑菌株毒力[22]、感染途径[23]、感染部位、感染剂量、感染动物免疫力等，建立满足实验需要的结核病模型。

[1]Okada M,Kobayashi K.Recent progress in mycobacteriology[J]. Kekkaku,2007,82(10):783-799．

[2]Dorman SE,Hatem CL,Tyagi S,et al.Susceptibility to tuberculosis:clues from studies with inbred and outbred New Zealand white rabbits[J].Infect Immun,2004,72:1700-1705.

[3]Gupta UD,Katoch VM.Animal models of tuberculosis[J].Tuberculosis,2005,85(5-6):277-293.

[4]Converse PJ,Dannenberg AM,Estep JE,et al.Cavitary tuberculosis produced in rabbits by aerosolized virulent tubercle bacilli[J].Infect immune,1996,64(5):4776-4787.

[5]Nedeltchev GG,Raghunand TR,Jassal MS,et al.Extrapulmonary dissemination of mycobacterium bovis but not mycobacterium tuberculosis in a bronchoscopic rabbit model of cavitary tuberculosis [J].Infect Immun,2009,77(2):598-603.

[6]Subbian S,Tsenova L,Brien PO,et a1.Phosphodiesterase-4 inhibition combined with isoniazid treatment of rabbits with pulmonary tuberculosis reduces macrophage activation and lung pathology[J]. Pathol,2011,179(1):289-301.

[7]Manabe YC,Kesavan AK,Lopez-Molina J,et a1.The aerosol rabbit model of TB latency,reactivation and immune reconstitution inflammatory syndrome[J].Tuberculosis,2008,88(3):187-196．

[8]Manabe YC,Dannenberg AM,Tyagi SK,et a1.Different Strains of Mycobacterium tuberculosis Cause Various Spectrums of Disease in the Rabbit Model of Tuberculosis[J].Infect immune,2003,71(10): 6004-6011．

[9]Subbian S,Tsenova L,O'Brien P,et al.Spontaneous latency in a rabbit model of pulmonary tuberculosis[J].Pathol,2012,181(5): 1711-1724.

[10]Subbian S,O'Brien P,Kushner NL,et al.Molecular immunologic correlates of spontaneous latency in a rabbit model of pulmonary tuberculosis[J].Cell Communication and Signaling,2013,11:1-16.

[11]Zhang G,Zhu B,Shi W,et a1.Evaluation of mycobacterial virulence using rabbit skin liquefaction mode1[J].Virulence,2010,1 (3):156-163．

[12]刘正文,宋兴华.建立新西兰白兔脊柱结核模型的实验研究[D].新疆医科大学,2012.

[13]刘莹,王云玲,王红,等.MR弥散加权成像在兔脊柱结核早期诊断中的应用价值[J].磁共振成像,2011,2(6):435-438.

[14]李万里,宋跃明.异烟肼缓释微球治疗家免膝关节滑膜结核的实验研究[D].四川大学,2006.

[15]吴启秋,段连山,梁桂芳,等.兔膝关节结核模型的建立及其应用[J].结核病与胸部肿瘤杂志,2002,3:174-176.

[16]毕龙，胡蕴玉.骨关节结核的相关实验研究[D].第四军医大学，2007.

[17]Tsenova L，Harbacheuski R，Sung N，et a1.BCG vaccination confers poor protection against M.tuberculosis HN878-induced central nervous system disease[J].Vaccine，2007，25：5126-5132.

[18]Tsenova L,Harbacheuski R,Moreira AL,et al.Evaluation of the Mtb72F polyprotein vaccine in a rabbit model of tuberculous meningitis[J].Infect Immun,2006,74(4):2392-2401.

[19]Tsenova L,Ellison E,Harbacheuski R,et al.Virulence of selected Mycobacterium tuberculosis clinical isolates in the rabbit model of meningitis is dependent on phenolic glycolipid produced by the bacilli[J].Infect Dis,2005,192(1):98-106.

[20]Jassal MS，Nedehchev GG,Osborne J,et a1．A modified scoring system to describe gross pathology in the rabbit model of tuberculosis[J].BMC Microbiol，201l,11(1):49．

[21]杨奇,卢润生,蒋绍双,等.急性结核菌感染所致冠状动脉损害的实验研究[J].中国防痨杂志,1999,21(4):191-193.

[22]Walsh GP,Tan EV,dela Cruz EC,et al.The Philippine cynomolgus monkey(Macaca fasicularis)provides a new nonhuman primate model of tuberculosis that resembles human disease[J].Nat Med, 1996,2:430-436.

[23]漆浩珊,卢润生,杨奇,等.不同毒力菌株与感染途径在树造结核动物模型中的作用[J].四川医学,1997,18(3)：150-152.

R-332

A

1003—6350（2014）03—0369—04

2013-07-25)

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.03.0142

广东省科学技术厅社会发展领域科技资助项目(编号：20120318095)

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