基于分子印迹聚合物的荧光传感器的制备及应用＊

刘燕婕， 胡玲娟， 伍雅婷， 吕 斌△

1长江航运总医院／武汉脑科医院检验科，武汉 430015

2湖北省卫生计生委综合监督局，武汉 430079

3华中科技大学同济医学院公共卫生学院环境医学研究所，武汉 430030

基于分子印迹聚合物（molecular imprinting polymers，MIP）的荧光传感器技术是将荧光与MIP相结合，通过光学信号的改变（包括荧光增强、荧光猝灭及波长改变等）来检测待测物。由于光学信号灵敏度高，非常适用于痕量物质的检测。而MIP又能选择性识别模板分子，将样品预处理和荧光检测两者结合起来，可实现快速、高灵敏度地检测靶分子。

1 分子印迹技术与传感器技术

1．1 分子印迹技术

分子印迹技术是制备对某一特定分子具有选择性识别能力聚合物的技术。MIP具有构效预订性、特异识别性、广泛实用性等特点［1］，目前在临床药物分析、环境分析等许多领域均得到广泛应用［2］。分子印迹材料还被应用于除草剂、杀虫剂、环境污染物、抗生素等物质［3－4］的检测和定量。

MIP主要用于合成具有单个模板或待测分子识别位点的聚合物或合成材料。它是一种模板诱导的原位形成识别位点的感测材料。除去模板分子以后材料的表面留下具有模板分子形状的识别位点，该位点可以结合模板分子，并与模板分子大小一致。通常情况下，目标物分子通过结合力以酶促反应的“锁－钥”模式被固定在印迹材料的识别位点上。这些结合力包括相对较强的共价键和离子相互作用，以及较为温和的氢键到较弱的范德华力［5］，因此MIP材料能够相对较强地选择性结合目标物。同生物识别材料相比，MIP材料具有一定的特殊功能，即在恶劣的环境条件下，MIP受体的稳定性与生物系统或生物分子相比更为优异［4］。MIP的制备通常包括3个步骤：模板分子和功能单体形成预组装复合物（氢键静电配位或共价键等作用）（预组装）；加入交联剂引发聚合，使目标官能团和互补的空间结构形式固定结合在聚合物中（聚合）；将模板从聚合物中除去（洗脱），从而获得特异结合识别模板分子的MIP。常见的分子印迹制备方式包括：本体聚合［6］，引发聚合后形成块状聚合物，经过粉碎、磨细、筛选等过程得到 MIP；悬浮聚合［7］，将单体、致孔剂和分散剂组成均一的混合溶液，加入引发剂搅拌后产生球状聚合物；分散聚合［8］，制备过程复杂，反应所需体系价格昂贵，分散剂不易除尽；表面印迹［9］，可以通过改变载体交联度、调整孔结构得到粒径不同的载体；水相印迹［10］，可制备水溶性MIP，合成的MIP形态多为颗粒和薄膜的形式。

1．2 传感器技术

传感器是一种可以对物理或化学刺激产生响应，并产生一个可测量的检测信号，以满足信息的传输、处理、存储、显示、记录和控制等要求的装置［11］。传感器由识别元件和信号转换装置组成。随着分析检测要求的不断提高，特别是药物分析、环境分析、食品分析和产品检测需求的日益增多，传感器作为一种重要的检测器件，越来越受到人们的关注，其应用十分广泛，已成为常规检测不可或缺的一部分。常用的传感器，如对不同温度产生响应而产生不同的输出电压的热电耦、交互式显示器屏幕的触摸传感器，以及对光、热或压力等外部物理刺激产生响应的传感器，其结构相对简单。而对原子或者分子刺激产生响应的化学传感器或生物传感器，其结构则较为复杂［12］。使用化学传感器和生物传感器识别原子和分子是传感器领域的一大趋势。化学传感器是将样品特定组分浓度或者样品总成分等化学信号转变为能够对目标物进行分析的化学或物理信号。生物传感器是一种使用生物识别元件选择性定量或半定量分析的设备，它具有接受器与转换器的功能［13］。这些传感器所使用的材料可以对目标分析物的存在产生响应信号，但产生的信号模糊，不一定能够正确反映目标物的存在。由于生物传感器的识别元件——生物识别材料在实际应用中其物理、化学性状并不稳定，例如，生物识别材料不耐酸、不耐热、不能适用于有机试剂环境、不能暴露于辐射中等，使得生物传感器发展受到明显限制。因此，在实际样品检测时，化学传感器和生物传感器只能选择性地检测复杂基质中目标物。但通常情况下，实际样品极为复杂，样品中存在许多不同浓度的干扰物质。为达到检测目的，传感器不仅需要对目标物敏感，而且需具备抗干扰物能力。样品预处理技术成为解决这个问题的关键环节［14－15］。样品预处理通常使用色谱分离、电泳分离或者膜萃取等方法［16－18］，预处理步骤较为复杂。当前，为了避免费时费力的样品预处理步骤，人们开发出能够模仿生物识别特性的、廉价、可再生、稳定的合成材料，以替代如抗体或酶等高成本、低可用性生物识别材料，使用这些材料作为识别元件，组建稳定实用的传感器。

2 基于MIP的荧光传感器的原理和作用方式

光致发光光谱是一种已被证实在化学传感方面十分有效的分析技术。由于其灵敏度和可靠性高，能快速、精确地识别光学信号的改变。随着材料科学、微电子技术以及计算机科学的进步，应用光致发光光谱学来发展新的分析方法逐渐成为研究的热点。特别是基于MIP的光致发光传感器（荧光传感器），代表了最近发展起来的一类将光学信号用于分析的新型材料传感器。在MIP制备过程中使用荧光功能单体和（或）荧光模板分子，使合成的MIP内部空腔形成特定的发色团或荧光基团，得到的MIP又称荧光 MIP（fMIP）［19－23］。荧光 MIP选择性地重新结合模板分子时，模板分子与MIP结合时的能量转移可导致荧光 MIP发生荧光变化［24－27］，包括荧光淬灭、荧光增强、荧光偏移。荧光猝灭可能在一定程度上影响检测的灵敏度，荧光增强则可提高检测的灵敏度。目前制备MIP荧光传感器的方法主要有4种：①检测本身具有光学性质的目标物，一般以荧光目标物为印迹分子，利用分子印迹技术制备成荧光MIP，然后通过测定识别前后荧光MIP的荧光变化对荧光目标物进行定性与定量测量。这种荧光传感器制备相对简单，检测便捷，但要求目标物本身具有荧光（至少要包含一种发色团或荧光团）。②使不发光的目标物同和它具有相同功能基团的发光类似物进行交换，合成具有荧光团的物质，将其直接作为荧光功能单体参与形成空腔，通过监测聚合物中目标物与荧光功能单体结合前后荧光信号的变化来检测目标物，合成的该荧光单体既为识别元件亦为探测元件；或采用分子印迹－荧光猝灭法，在MIP中包埋荧光试剂，利用荧光猝灭分析方法分析目标物。③在聚合物合成中使用发光指示分子检测荧光标记竞争物，该方法不需要合成具有发色团或荧光团的功能单体，避免了模板分子对痕量目标物分析检测时的干扰，已被证明同免疫检测有类似的灵敏度［28］。④使用具有选择性的，作用于目标物的发光聚合物。

3 各种MIP荧光传感器的制备和应用

3．1 离子的检测

制备离子分子印迹聚合物（ion－imprinted polymer，IIP）是使用MIP开发化学传感器技术的一个很有趣的应用，该技术可以在干扰物存在的情况下检测痕量离子。在固相萃取（solid－phase extraction，SPE）或者电化学传感中，离子通常不能直接印迹于聚合物中，而是与发光基质形成配位键之后，随着发光基质进入聚合物中达到光致发光的目的。这种传感方式是基于离子和发光基质的配位键的形成和断裂而导致的发光基质光学信号的改变。尽管大部分离子检测是使用的电化学方法，但仍存在使用光致发光检测Al3＋的方法。

由于Al3＋在工业和饮用水中的广泛应用而导致了许多疾病，因此制备和评价用于Al3＋检测的离子分子印迹聚合物具有十分重要的意义［29］。Al－Kindy等［30］利用桑色素（3，5，7，2′，4′－五羟黄酮）能与Al3＋配位而发光，合成了一种新型荧光MIP。此种聚合物使用MIP制备的经典方法本体聚合合成，经过研磨和过筛，最后被放置于一个小反应器中，并在流溢条件下进行实验。为了防止化学传感颗粒在流通池中被冲走，该MIP被固定在尼龙网上。该法使用甲苯、二氯乙烷和乙腈作为溶剂。当激发波长为450nm时，Al3＋结合桑色素形成配位键使得MIP在525nm处出现荧光增强。在最优分析条件下，该传感器的线性范围最高到1μg／mL，检出限在0．01μg／mL。该方法与其他基于光学纤维或流溢测量法的离子发光化学传感器相比结果一致性较高。大量交叉反应实验证实，其他离子对MIP的影响没有显著性差异，同Al3＋相比，当 Mg2＋存在于甲苯中时，MIP的荧光显著增强（约为总强度的50%），当Be2＋存在乙腈中时，荧光增强强度相当于Al3＋的90%。

IIP的另一用途是用于对识别Al3＋的 MIP进行表征并优化［31］。8－羟基喹啉－5－磺酸的空间性能络合Al3＋离子而产生超分子结构，随后可使用乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）同2－甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）热共聚来固定该结构。使用本体聚合合成 MIP后，再将 MIP粉碎使用。与 Al－Kindy等［30］方法不同，该研究使用了水相溶液，但仍使用了相同的分析流通池系统用于探讨MIP的性能。当激发波长为365nm时，MIP结合Al3＋后495nm处的荧光强度下降。同时，对存在阳离子（Cu2＋，Ca2＋，Mg2＋，Pb2＋，Co2＋，Cd2＋以及Zn2＋）干扰的情况下，对传感器的响应进行检测发现，当Al3＋和阳离子比例为1∶1时，荧光响应没有明显的改变。当阳离子比例为1∶5和1∶10时，Zn2＋对检测有影响。而其他阳离子干扰的影响并不显著。10min反应后线性动态浓度范围达到1．0×104mol／L，检出限为3．62μmol／L。Güney等［32］于2002年合成了用于检测Pb2＋的荧光 MIP，以 MAA为功能单体，N－乙烯基咔唑为荧光功能单体，AIBN热引发聚合，采用盐酸为洗脱液，检测结果显示Pb2＋导致MIP荧 光 猝 灭，检 测 范 围 在 10－6mol／L 至 10－2mol／L之间。

众所周知，汞在生活中被广泛使用，例如温度计、压力计以及科学仪器设备等，然而，汞具有剧毒性以及易反应性，检测汞相关的污染物存在较大困难。因此，开发一种用来检测汞的荧光IIP膜是非常重要的［33］。用来检测Hg2＋的膜由4－乙烯基吡啶和9－乙烯基咔唑2种荧光功能单体合成，通过基于Hg2＋的孤对电子与吡啶和咔唑结合形成络合键而与 Hg2＋结合。该膜的线性范围是5×10－7mol／L到1．0×10－4mol／L，当 Hg2＋浓 度 为 1．0×10－5mol／L时，该传感器对所有竞争离子都有响应。然而当竞争性离子Cu2＋（4．87%）和Pb2＋（4．57%）存在时，尽管对传感器的识别能力影响最大，但在该影响下传感器仍能很好地检测Hg2＋。这一进展促进了IIP的进一步发展。

3．2 生物分子的检测

天然识别物质，例如酶或者抗体，能特异性地结合生物分子，该类物质的化学稳定性很低，仅能在严格的温度和pH范围内保持稳定。同时，这些生物受体的制备非常复杂，并经常需要进行动物实验（例如制备抗体时）。相比之下，MIP的物理和化学抗性较高，因此MIP化学传感器的易降解性与生物传感器相比具有众多优势。然而MIP传感器仍有一些限制。比如当模板分子不能完全从MIP中去除时，MIP的灵敏度将会降低。更重要的是，MIP具有较低的生物相容性。此外由于存在非选择性识别位点，MIP对目标物的选择性可能会降低。尽管现在已合成的许多发光MIP化学传感器的传感表现良好，但是至今仍没有建立其设计制造的通用流程。

Chow等［34］以MAA为功能单体，将非荧光性模板高半胱氨酸荧光化，制备成荧光MIP测定血浆中高半胱氨酸的含量，其结合常数KB为（9．28±1．6）×10－5mol／L，最大结合容量 Bmax为（11．9±0．8）nmol／g。MIP荧光强度的变化与血浆中高半胱氨酸的浓度呈线性相关。Urraca等［35－36］则首先合成玉米赤霉烯酮毒素的结构类似物cyclododecyl 2，4－dihydroxybenzoate（CDHB），然后以 CDHB为荧光模板，1－烯丙基哌嗪为功能单体，合成可特异性结合玉米赤霉烯酮毒素的荧光MIP，可检测食物样品中浓度范围为5．0×10－5mol／L 至5．0×10－4mol／L的玉米赤霉烯酮毒素。Turkewitsch等［37］发明了一种用于检测3’，5’环磷酸腺苷（cAMP）的荧光传感器，其荧光功能单体是反式－4－［1，4－（N，N－二甲基氨基）苯乙烯基］－N－乙烯基苄基氯化物（vb－DMASP）染料。在这种MIP中荧光染料能同时识别和检测cAMP。带正电的vb－DMASP染料与带负电荷的cAMP相互作用形成预聚合的复合物之后，本体聚合的MIP被粉碎研磨，用于检测不同浓度cAMP水溶液。当激发波长为469nm时，MIP与目标物相结合后在发射波长595nm处的荧光强度降低，而vb－DMASP的发射波长在蛋白自荧光可以忽略的范围内，能避免蛋白自荧光的干扰。由于结合位点的饱和，MIP的动态线性范围是10～100 μmol／L，复合稳定系数 KMIP＝（3．5±1．7）×105L／mol。通过对类似物3’，5’环鸟甘酸（cGMP）的交叉反应实验证实cAMP－MIP对水性cAMP有很高的亲和力和选择性。随后有研究者进行了一系列关于vb－DMASP应用于 MIP 的研究［38－39］。在这些研究中，使用时间分辨荧光光谱研究本体荧光MIP。荧光寿命参数表明MIP荧光随着cAMP浓度的升高而降低。而荧光衰变实验证实有2种不同类型的空腔存在于聚合物中。一种是易于结合和进入的空腔，另一种是深埋于聚合物内部不易进入的空腔。随着目标物初始浓度的升高，MIP的荧光寿命逐渐降低。然而研磨后颗粒表面可进入的识别位点易受损，为了解决这一问题，该研究合成了一种识别cAMP的MIP薄层［40］。与本体 MIP类似，当 MIP沉积于石英基质上成为薄片后，与vb－DMASP结合发生荧光猝灭现象。由于MIP与cAMP相互作用所引起的荧光猝灭更为有效，其复合稳定系数105≤KMIP≤106L／mol，同时由于cAMP结合位点的亲和性不同，故存在本体MIP的KMIP和薄层MIP相比有所不同。另有研究者合成了一些新型cGMP的荧光 MIP［41－42］。在薄层荧光 MIP传感器中，使用1．3－二 苯 基－6－乙 烯 基－1H－吡 唑 并 ［3，4－b］喹 啉（PAQ）作为荧光指示剂与cGMP反应，以及使用稳态荧光光谱和时间分辨荧光光谱分析技术来独立研究当cAMP存在的情况下该化学传感器的相关性质，稳态荧光光谱法常被用于MIP检测，而使用时间分辨荧光光谱结合显微镜技术是一种MIP检测的新方法。在类似的研究中［43］，合成本体cGMPMIP时，使用2－丙烯酰胺基吡啶用作为荧光信使。相对于类似物GMP和cAMP，该MIP对水性cGMP具有高亲和力和高选择性，其激发波长为355nm，发射波长为460nm。当目标物浓度为100 μmol／L时，荧光浓度依赖性淬灭达到最高水平，复合稳定系数KMIP为3×105L／mol。这些结果与前面所述的研究结果具有良好的一致性［40］。

3．3 化学战剂及毒物的检测

化学和生物战技术以及农业产业的进步刺激了复合毒物的发展。虽然化学和生物武器已被禁止，但神经毒气和毒素仍有库存［44］。另外，由于农业中经常使用杀虫剂而使杀虫剂进入环境中造成显著污染。当有机磷农药存在时，传统的神经毒气传感器易产生假信号。而基于MIP技术的化学传感器则能选择性地结合化学战剂［45］。当潜在威胁存在时，由于经过增强的光信号易于检测、传送，光信号能即时传递信息，所以荧光传感器是检测神经毒剂的一种十分有效的手段。

MIP混合Eu3＋能对一种化学战剂模拟物——甲基水杨酸盐（MES）进行光学检测。因为Eu3＋的吸收峰在近紫外区，所以Eu3＋与 MIP混合能够在375nm处被常用的激光二极管所激发，于是在石英基底玻片上合成一层 MIP混合Eu3＋的薄膜。该MIP和NIP薄膜都进行了检测己烷中的MES和结构类似物亚甲基－3，5－二甲基苯（DMB）的测试，MES－MIP的荧光强度明显比其NIP荧光强度强，而DMB－MIP的荧光强度也大于其NIP。最近Southard等［46］新合成了一种含有Eu3＋的用于检测百治磷的MIP复合物。使用可逆加的断裂链转移（RAFT）聚合及关环复分解（RCM），来获得具有能形成嵌段共聚物的MIP侧臂。当激发波长为338 nm时，这种含有Eu3＋的MIP在614nm处有一锐峰，半峰宽为10nm。该MIP在0～200ppb对百治磷敏感，但高于该浓度时达到饱和状态。对百治磷的类似物——敌敌畏、二嗪农和甲基膦酸二甲酯进行了交叉反应测试，结果表明，即使在比百治磷的初始浓度高得多的浓度下（＞1 000ppb），该MIP对类似物仍没有表现出任何光响应性。Sánchez－Barragán等［47］于2007年报道了一种用于检测胺甲萘的荧光MIP传感器，采用流动注射方式检测胺甲萘的荧光，结果表明，该传感器线性检测范围为5～50μg／L，检 测 限 可 达 到 0．27μg／L。Lieberzeit等［48］于2008年报道了用于检测芘的荧光传感器，该传感器以2种多环芳烃为模板分子，以含有25%三异氰酸酯的4，4′－亚甲基双（异氰酸苯酯）作为功能单体与交联剂，加入聚乙二醇，同时混溶于嘧啶溶液中进行预聚合，然后旋涂于石英板上，最后去除模板分子。荧光传感器检测限低于10ng／L，吸附饱和浓度为15g／L，易受荧光猝灭和分子激发态的影响。

另外，MIP还被用于检测包括农药和杀虫剂等在内的非水解有机磷农药［49］。当与目标物接触时，这些MIP化学传感器的发光强度增大，这种增强是由于水的斥力以及目标物与铕的共价结合而引起的。当激发波长为466nm时，在610nm到625nm处发光增强。厚度为400μm的MIP薄膜涂覆在光纤的前端，检出限小于10ppt，响应时间少于15 min，并且具有很宽的动态线性范围。甲基毒死蜱（吡啶有机硫代磷酸酯类）、二嗪农（嘧啶有机磷）和草甘膦（平面有机磷）这3种不同类别的化合物被用作MIP的模板分子，其检出限分别为7、9、5ppt；当pH＝10．5，响应时间分别为15、12、14min；动态线性范围最高浓度为100ppm。对类似物毒死蜱－乙基、蝇毒磷或敌敌畏等都进行交叉反应实验，这些MIP的化学发光均无显著增强。

近年来，同样有使用量子点（QDs）作为MIP荧光信使来检测硝基炸药的研究［50］被发表。这些研究指出，其MIP对DNT和TNT水溶液的检出限分别为30．1μmol／L和40．7μmol／L。虽然这是一项较新的MIP技术，但其检出限比其他灵敏的TNT检测系统的检出限低出100倍，如果改良了该系统的胶体稳定性和微粒的粒度分布，这项研究将开创一种新的用于制备MIP化学传感器的合理方法。

另外还有一些联合使用量子点和MIP来检测拟除虫菊酯的新方法。拟除虫菊酯类农药是常用的杀虫剂，被广泛应用于农业、医药、工业及家用杀虫中。该研究显示［23］，量子点被固定在具有λ氯氟氰菊酯印迹位点的硅胶颗粒上，当目标物浓度升高时荧光强度降低。相较于其他拟除虫菊酯（氯氰菊酯、氯菊酯和溴氰菊酯），该纳米MIP薄层对λ氯氟氰菊酯有很好的选择性（3倍），检出限为3．6mg／L，回收率为96%。另有一种围绕量子点合成聚合物外壳的方法优于量子点镶嵌法：较大的比表面积，可与更多分析物结合；识别位点和量子点间距离较短导致更强的量子点发光。该系统的缺点则在于重结合时量子点胶体系统十分稳定。利用这种方法，Wang等［51］合成了一种能检测水中五氯苯酚的MIP。五氯苯酚是一类用作除草剂、杀虫剂或木材防腐的有机氯化合物。五氯苯酚的短期暴露可对重要器官，如肝、肾或肺，产生严重损害，基于修饰Mn的硫化锌量子点的MIP光学传感器通过化学发光的改变可以用来检测水样中的五氯苯酚。该MIP能在nmol／L浓度下识别目标物，而当其他有机氯存在时，其NIP也能识别五氯苯酚。2009年还报道了一种采用卤化双酚作为识别元件，用于识别水中甲萘威（1－萘基甲基氨基甲酸酯）的具有高度选择性的MIP［52］。甲萘威属于氨基甲酸酯类化合物，它主要用作家庭花园、商业性农业杀虫剂用来保护植被。使用本体聚合制备含有和不含有卤原子（溴或碘）的MIP，引入重卤原子，能在重卤原子引起的室温磷光的基础上检测识别目标物。这种方法克服了传统荧光检测的常见缺点，如荧光寿命短和易散射等，但是该分析信号对温度敏感，在这种条件下，卤化的MIP对甲萘威的响应比NIP高4～10倍。Fang等［53］还合成了一种基于流动注射的化学发光系统的用于检测马来酰肼的荧光MIP化学传感器。马来酰肼是一种用于蔬菜储存的暂时性植物生长抑制剂。当马来酰肼与碱性鲁米诺－高碘酸钾反应，产生强大的后发光现象，可以使用光电倍增管来检测该种光电信号。反应结束后，被吸收的目标物被流动液带走除去，而MIP上的空腔能再次吸附目标物。该马来酰肼－MIP的动态线性范围是3．5×10－4mg／L至5．0×10－2mg／L，检出限为6．0×10－5mg／L，并自称比其他除草剂常规检测方法的检出限要低得多。

4 小结

本文阐述了在过去十几年中荧光传感器取得的重大进展。通常情况下，因文献中所合成的材料使用了不同的参数来表征其重要特性，所以很难评估合成材料的质量，因此本文使用了最典型的、最重要参数（复合稳定常数和检测线）来评价这些纳米材料。大部分的光学传感方法是基于单波长的荧光测量，其波长是由荧光指示染料所决定的，目标物与指示剂相互作用而导致荧光强度改变。开发更多特殊的指示剂，更精确地定制MIP的结构以及在纳米尺寸上使用MIP技术等方向都是未来MIP研发的热点。纳米MIP上使用新的指示剂将有可能提高选择性分子印迹位点的生成率。由于纳米颗粒的表面积显著减少，目标物在纳米MIP中的扩散运动比在本体MIP或薄层MIP中的更为有效。此外，使用核－壳结构，可以开发出其外壳具有印迹位点的纳米颗粒。通过调整纳米级壳层的厚度，可以显著降低化学传感器的响应时间。随着纳米粒子的壳结合更加敏感和更具选择性的指示剂技术的应用，通过流通式系统或生物芯片阵列技术可以连续检测各种分析物。这些新技术的开发和使用将使得实验室中的医学研究成果顺利转化为工业生产中的过程分析技术。

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