黄芪多糖对免疫功能影响的体外实验研究

2014-03-30刘印华李树义赵志强张庆波

河北医药 2014年18期

刘印华李树义赵志强张庆波

黄芪桂枝五物汤载于《金匮要略·血痹虚劳病脉证治》，该方由黄芪、芍药、桂枝、生姜、大枣五味药组成，具益气温经、和营通脉之功［1］。原方主要是治疗血痹，而现代临床应用已远远超越了原方“血痹”症的范畴，尤其是在治疗类风湿性关节炎、微循环障碍和脑中风后遗症等方面，收到满意的疗效［2］。长期以来备受中医学者青睐，是临床常用经典名方之一。黄芪是黄芪桂枝五物汤中的主要成分之一，黄芪多糖具有多种重要的生物学作用，包括对免疫功能的影响，但黄芪多糖对机体免疫功能影响的系统研究，经河北省医学情报研究所查新(编号:13010520130618)目前在国内外尚未见文献报道。本项目将通过小鼠脾细胞体外实验，系统研究黄芪多糖对免疫功能的影响，为临床应用和相关产品的开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料黄芪多糖:由河北联合大学药学院提供。测增殖用试剂WST-1:购于江苏碧云天生物科技公司。

1.2 实验用动物取4～6周龄昆明种小鼠，体重(20±2)g，雌雄各半，SPF级，购自北京军事医学科学院。(合格证编号:0123883)

1.3 小鼠脾细胞增殖活性的测定取5周龄小鼠4只，雌雄各2只，颈椎脱臼处死，无菌分别取脾脏，细胞筛研磨成脾淋巴细胞悬液，加入1 ml蒸馏水破碎红细胞，30 s后加入1.8%氯化钠溶液，PBS洗细胞3次，计数细胞数，调细胞浓度为1.0×106/ml。在96孔细胞培养板中，每孔加100 μl细胞悬液，10 μl不同浓度的黄芪多糖溶液(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/ml)，同时设不加黄芪多糖的对照组。每组设3个复孔，置CO2培养箱中分别培养3、6、9 d，用WST-1测OD值，4只小鼠取均值。

1.4 小鼠IL-2，IFN-γ的测定上述细胞测定增殖前，取上清50 μl置于-80℃冰箱中保存备用。样品收集完毕后，分别检测IFN-γ、IL-2的含量(按酶联免疫试剂盒说明书的要求操作)。

1.5 细胞亚群分析检测小鼠脾细胞中CD+3细胞和细胞。取小鼠脾淋巴细胞悬液，以5×106/ml的浓度接种于24孔培养板中，每孔1.5 ml，实验组加入2.0 mg/ml的黄芪多糖溶液0.5 ml，对照组加入0.5 ml RPMI-1640培养液，培养6 d后，取细胞悬液，1500转/min，离心5 min;PBS洗涤;加入FITC进行免疫标记反应(100 μl细胞悬液∶100 μl抗体)，避光孵育30 min;PBS洗2次，每管加入200 μl 1%多聚甲醛固定，流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 黄芪多糖对小鼠免疫细胞增殖活性的影响实验结果显示黄芪多糖对小鼠脾淋巴细胞有刺激增殖作用，其最佳浓度为2 mg/ml(P＜0.05或＜0.01)。见表1。

表1 黄芪多糖对小鼠免疫细胞增殖活性的影响±s

注:与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

黄芪多糖(mg/ml)3 d6 d9 d 0.47±0.120.86±0.211.11±0.52 0.251.42±0.65*2.54±0.57*2.77±0.73*0.52.78±0.33#3.43±0.36#4.41±0.32#1 3.56±0.66#4.65±0.34#5.52±0.73#2 4.24±0.20#4.87±0.34#6.76±0.56#4 4.31±0.64#4.78±0.39#6.79±0.46 0#

2.2 细胞上清IFN-γ的测定ELISA检测结果显示:黄芪多糖组IFN-γ的含量显著高于对照组(P＜0.05或＜0.01)。培养3、6和9 d，的黄芪多糖组以2.0 mg/ml浓度最高，高于此浓度时，其含量不再增加。见表2。

表2 IFN-γ的测定n=4，pg/ml，±s

注:与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

时间(d)黄芪多糖(mg/ml)0(对照)0.250.5124±3 3.65±0.135.66±1.22*6.78±1.02*7.96±1.56#9.47±1.78#9.66±1.77#5.31±1.249.42±1.78*11.56±1.54#13.48±2.78#17.73±2.89#17.62±2.65#9 9.21±1.7617.34±3.15*20.12±3.45#22.31±3.77#29.55±3.96#29.67±4.63 6#

2.3 IL-2的测定黄芪多糖组IL-2的含量随着黄芪多糖浓度的增加而升高，以2.0 mg/ml浓度效果最明显(P＜0.05或＜0.01)。见表3。

表3 IL-2的测定n=4，pg/ml，±s

注:与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01

时间(d)黄芪多糖(mg/ml)0(对照)0.250.5124 3 4.33±0.216.56±0.33*8.47±2.12*9.63±2.11#12.65±3.24#12.45±2.11#7.21±1.3210.23±3.42#12.89±3.24#16.67±3.78#19.68±5.12#19.44±3.89#9 10.34±3.3517.56±5.21#20.33±5.13#21.23±5.77#32.54±6.87#32.64±5.28 6#

表4 CD3亚群的检测

表5 亚群的检测

组别细胞总数标记细胞未标记细胞CD+19细胞占细胞总数的百分比(%)χ2值P值10 0002429 7582.7328.8834＜0.001黄芪多糖组对照组10 0004599 5414.59

3 讨论

黄芪桂枝五物汤的药理学研究主要集中在饮片层次，从整体效果及拆方后药物的配伍组合，如:王妮等［3］进行了黄芪桂枝五物汤加减，治疗血液高粘滞综合征;马丽［4］用黄芪桂枝五物汤治疗糖尿病周围神经病变微循环障碍的患者;赵桂华等［5］运用黄芪桂枝五物汤对小鼠的免疫调节作用进行了研究;许利平等［6］对黄芪桂枝五物汤加味的药效作用研究证实该方有一定程度的镇痛、抗氧化作用;黄兆胜等［7］对黄芪桂枝五物汤及其配伍抗炎镇痛的比较研究将该方按药对研究法拆方分组;施旭光等［8］进行了黄芪桂枝五物汤及其配伍对佐剂性关节炎大鼠的抗炎、抗氧化作用研究;许晓峰［9］等证实黄芪桂枝五物汤有抑制佐剂性关节炎大鼠血清中IL-1β、TNF-α升高的作用。

对复方中各单味药化学成分及药理作用研究，如:黄芪中含有的黄芪多糖、皂苷、黄酮等化合物具有较强的生物活性，黄芪皂苷主要作用于心脑血管，通过扩张血管达到降压目的;黄芪多糖主要作用于多种免疫活性细胞，促进细胞因子的分泌和正常机体的抗体生成［10］。桂枝的有效成分是挥发油，主要为桂皮醛和桂皮酸，可扩张血管，促进发汗、解热、镇痛、镇静、利尿［11］。芍药中的主要有效成分为芍药总苷，现被广泛用于治疗类风湿关节炎等自身免疫性疾病［12］。大枣中含有多种有效成分，如大枣多糖、黄酮类、皂苷类、三萜类、生物碱类等。大枣多糖是大枣中重要的活性物质，有促进淋巴细胞增殖作用，可提高机体免疫力。大枣中的黄酮类物质对脑缺血所致的脑组织超微结构损伤有保护作用。大枣中所含的皂苷类物质，具有调节人体代谢、增强免疫力、抗炎、抗变态反应、降血糖和胆固醇等作用［13-15］。

黄芪是黄芪桂枝五物汤中的主要有效成分之一，研究结果表明:黄芪多糖能刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，促进细胞因子的分泌。在一定浓度范围内，随着黄芪多糖浓度的增加，细胞增殖效果也随之增加，IL-2和IFN-γ的分泌量亦如此，具有明显的量效关系。相关研究显示多糖对B细胞有促进增殖的效果［16］，但对T细胞的作用则取决于多糖种类［17］，本实验在检测细胞亚群时发现T、B细胞均有大幅增长，表明黄芪多糖对机体的细胞免疫、体液免疫均有显著的增强作用。

黄芪多糖的研究较多，但缺乏对其进行系统深入的研究，本项目将对其进行系统深入研究，包括体外研究和体内研究，可望对黄芪的作用有全面了解，以便在临床得到更好的应用。

1 黄仰模主编.金匮要略讲义.第1版.北京:人民卫生出版社，2003.71-72.

2 赵蕊，蒋明.黄芪桂枝五物汤的临床应用.黑龙江中医药，2007，4:60-62.

3 王妮，方瑜，袁有财，等.黄芪桂枝五物汤加减治疗血液高粘滞综合征.陕西中医学院学报，2007，30:19-20.

4 马丽.黄芪桂枝五物汤对糖尿病周围神经病变微循环障碍的影响.辽宁中医杂志，2006，33:140-141.

5 赵桂华，唐其风.黄芪桂枝五物汤对小鼠的免疫调节作用.中国冶金工业医学杂志，2006，23:708-709.

6 许利平，胡晓梅，任桂华，等.黄芪桂枝五物汤加味的药效学研究.四川生理科学杂志，1999，21:30.

7 黄兆胜，施旭光，朱伟，等.黄芪桂枝五物汤及其配伍抗炎镇痛的比较研究.中药新药与临床药理，2005，16:93-96.

8 施旭光，朱伟，黄兆胜，等.黄芪桂枝五物汤及其配伍对佐剂性关节炎大鼠的抗炎、抗氧化作用研究.中药新药与临床药理，2006，22:3-5.

9 许晓峰，林斌，王沛坚.黄茂桂枝五物汤对AA大鼠血清IL-1β、TNF-α的影响.现代生物医学进展，2007，7:1202-1204.

10 卢彦琦.黄芪化学成分及药理作用综述.保定师范专科学校学报，2004，17:40-42.

11 刘江云.桂枝的化学成分研究.中草药，2002，33:681-683.