氯沙坦对糖尿病大鼠肾组织降钙素基因相关肽和内皮素-1表达的影响

何伟 李英 胡志娟 马云娜 高占红

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)发病机制复杂，主因是肾血流动力学及非血流动力学两大因素综合作用的结果，涉及到肾素-血管紧张素、降钙素基因相关肽(calcitonin-gene-related peptide，CGRP)、内皮素-1(endothelin，ET-1)等多种血管活性肽类物质的相互作用。本研究应用糖尿病大鼠模型，观察CGRP和ET-1在糖尿病大鼠肾组织的表达情况以及氯沙坦对两种肽类物质的影响。

1 材料与方法

1.1 糖尿病大鼠模型的建立和分组 选取体重120～150 g健康雄性Wister大鼠(河北医科大学实验动物中心供给)42只，随机分成对照组、糖尿病组及氯沙坦组，每组14只。糖尿病组和氯沙坦组大鼠腹腔一次性注射链尿佐菌素(溶于0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液，pH值4.5)65 mg/kg，72 h后取尾静脉血，测血糖 ＞16.65 mmol/L(美国强生One TouchⅡ血糖仪测定)，表明造模成功;正常对照组大鼠以等量枸橼酸缓冲液一次性腹腔注射。氯沙坦组大鼠给予氯沙坦30 mg·kg-1·d-1灌胃，对照组和糖尿病组大鼠给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。实验期间大鼠自由进食、进水，不使用胰岛素及其他降糖药，每天测体重1次。于实验第8周处死3组动物，处死前1 d采用代谢笼留取24 h尿液，测24 h尿蛋白定量;处死当天股动脉取血，分离血清测血糖、尿素氮、肌酐;取双肾去包膜称重。取部分肾组织置于4%多聚甲醛固定，用于免疫组织化学检测;部分肾组织提取总RNA。

1.2 光镜观察及图像分析 肾组织石蜡切片，HE染色，光镜观察。每张切片随机选取20个肾小球，用自动图像分析仪计算其平均截面积(average sectional acreage，AG)，并根据公式1.38/1.1(AG)3/2计算平均体积(average volume，VG)。

1.3 免疫组织化学染色 采用SABC法:石蜡切片经二甲苯及乙醇脱蜡，滴加3%过氧化氢孵育5 min，以灭活内源性过氧化物酶;蒸馏水冲洗3次，每次2 min，0.01 mol/L PBS浸泡5 min，10 mmol/L的枸橼酸钠微波抗原修复10 min;自然冷却后，加10%正常山羊血清封闭液室温封闭10 min;倾去封闭液后滴加1∶100稀释的一抗(兔抗小鼠CGRP和ET-1抗体)，4℃过夜(以PBS代替一抗作为阴性对照);0.01 mol/L PBS清洗5 min 3次，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗工作液(山羊抗兔IgG)，37℃孵育20 min;0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min;滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素(1∶200稀释)，37℃孵育20 min;0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min。滴加DAB试剂显色，显微镜下控制显色时间，以组织中出现棕黄色颗粒为阳性染色。自来水冲洗终止反应，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。在400倍光镜下分肾小球、皮质肾小管-间质、外髓肾小管-间质、内髓肾小管-间质各选10个视野，利用病理图像分析系统测定阳性着色面积比×平均灰度，并求均值。

1.4 RT-PCR分析检测肾组织CGRP与ET-1mRNA表达 采用TRIzol试剂(异硫氰酸胍-酸性酚一步法)提纯各组肾组织总RNA，加入反转录体系于42℃进行3 h，将CGRP和ET-1的引物加入PCR反应体系，进行30～40次PCR循环。CGRP上游引物5’CGTGATCTTCTCTCTGCTGT3’，下游引物5’TTGACCCAGATGATGTCCAG3’;ET-1上游引物5’GACTCTTGCTCCTGTACCAG3’，下游引物5’CTCCCTGACTTTCATCTGAC3’。将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，置于凝胶图像分析系统(Bio-Rad公司，美国)进行吸光度扫描。

1.5 统计学分析 应用SPSS 11.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验8周时3组大鼠一般情况及肾功能指标与对照组比较糖尿病组肾重/体重、血糖、24 h尿蛋白定量(TP/24 h)、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)明显增高(P＜0.01)。氯沙坦组肾重/体重、血糖、TP/24 h、SCr、BUN明显低于糖尿病组而高于对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 3组大鼠实验8周后血糖、肾重/体重、TP/24、Scr和BUN比较n=14，±s

表1 3组大鼠实验8周后血糖、肾重/体重、TP/24、Scr和BUN比较n=14，±s

注:与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01;与糖尿病组比较，△P＜0.05

组别 血糖(mmol/L)肾重/体重(×10-3)TP/24(mg)Scr(μmol/L)BUN(mmol/L)对照组7.10±0.604.81±0.475.67±1.5142.35±1.798.11±0.46糖尿病组33.82±1.10#8.58±0.14#26.83±3.97#69.23±2.78#15.07±0.17#氯沙坦组28.18±1.15＊△6.62±0.18＊△14.33±2.42＊△52.44±1.73＊△11.90±0.98＊△

2.2 肾组织形态学改变 对照组大鼠肾小球未见异常;糖尿病组大鼠可见92%肾小球系膜细胞增生，基质弥散性增高，AG和VG增大(P＜0.01);氯沙坦组AG和VG较糖尿病组下降，较正常组增大(P＜0.05)。见表2。

表2 3组大鼠实验8周后肾小球AG和VG检测结果比较n=14，±s

表2 3组大鼠实验8周后肾小球AG和VG检测结果比较n=14，±s

注:与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01;与糖尿病组比较，△P＜0.05

组别AG(A/μm2×104)VG(V/μm3×106)0.95±0.091.19±0.15糖尿病组1.30±0.19#2.11±0.20#氯沙坦组1.11±0.12＊△1.59±0.14对照组＊△

2.3 免疫组化结果CGRP与ET-1在3组大鼠肾组织中均有表达，CGRP主要分布在肾小球固有细胞、肾小管上皮细胞及鲍曼氏囊中，ET-1主要分布于肾小球固有细胞、系膜细胞及肾小管上皮细胞中。免疫组化病理图像分析结果示:与对照组相比糖尿病组肾组织中CGRP表达明显降低，ET-1表达明显升高(P＜0.01);氯沙坦组较糖尿病组肾组织CGRP表达明显升高，ET-1表达明显降低(P＜0.05)。见表3，图1、2。

表3 3组大鼠实验8周后CGRP与ET-1免疫组化染色均数比较n=14，±s

表3 3组大鼠实验8周后CGRP与ET-1免疫组化染色均数比较n=14，±s

注:与对照组比较，*P＜0.05，#P＜0.01;与糖尿病组比较，△P＜0.05

CGRPET-1对照组组别2.85±0.190.46±0.15糖尿病组0.89±0.12#2.17±0.19#氯沙坦组1.76±0.14＊△1.29±0.18＊△

图1 CGRP在3组肾组织中的表达(免疫组化×400)

图2 ET-1在3组肾组织中的表达(免疫组化×400)

2.4 RT-PCR结果RT-PCR密度梯度扫描结果:与对照组相比糖尿病组肾组织中CGRP的mRNA表达明显降低，ET-1的mRNA表达明显升高;氯沙坦组较糖尿病组肾组织CGRP的mRNA表达明显升高，ET-1的mRNA表达明显降低。见图3。

3 讨论

CGRP是由37个氨基酸组成的活性多肽，是体内最强的舒血管物质之一;ET-1是由21个氨基酸组成的酸性多肽，是目前所知体内作用最强的缩血管活性多肽之一。研究表明，CGRP是ET-1有效的内源性拮抗剂，它通过下调ET-1受体的密度而拮抗ET-1的生物学效应，CGRP可以抑制致炎细胞因子，如TNF-β、IL-1和IL-2的产生，双向调节IL-6的产生(小剂量增加，大剂量抑制)，增加NO和前列腺素的产生，抑制ET-1的合成［1，2］;而ET-1通过对血管的收缩作用，引起组织缺血、缺氧，造成高乳酸环境，可直接刺激CGRP的神经兴奋，引起CGRP的释放增加，二者处于相对平衡状态［3］。

图3 3组大鼠肾组织中CGRP与ET-1mRNA的表达比较

本实验结果显示糖尿病组较对照组肾重/体重、血糖、TP/24 h、SCr、BUN明显增高，肾小球AG和VG增大，表明糖尿病组出现肾脏功能和形态的改变，检测CGRP表达减少，其mRNA表达下调，而ET-1表达升高，其mRNA表达上调，表明CGRP与ET-1的失衡在糖尿病肾病发病中存在一定作用。文献报道，糖尿病患者血浆ET增加，可使血管内皮细胞受损，内皮细胞损伤可导致组织缺、缺血，CGRP免疫反应纤维减少，使CGRP释放减少［3，4］;并且一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)减少，不能介导CGRP释放增多，引起CGRP，减少［5］。高血糖状态损伤血管内皮细胞引起ET-1的大量释放;缺氧、血管内皮细胞损伤，高胰岛素血症，高三酰甘油血症等因素可促进ET-1合成及释放增多。在糖尿病肾病中，随CGRP下降，ET升高，使血管的舒张作用及内皮的保护作用减弱，诱导血管收缩，微循环障碍，造成出、入球小动脉收缩加重，特别是出球小动脉，引起肾小球内高灌注、高滤过、高压的三高状态，从而出现蛋白尿;随病情进展，转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)上调，促进血管平滑肌细胞、系膜细胞的增殖，肾小球体积增大，继而肾小球硬化，降低肾小球的滤过率，造成肾功能受损。

糖尿病的发生、发展中，肾脏局部RAS系统活性增强，应用氯沙坦有明确治疗作用。本实验显示氯沙坦治疗组较糖尿病组比较肾功能指标明显减轻，肾小球肥大减轻;并且CGRP表达增加，其mRNA表达上调，而ET-1表达减少，其mRNA表达下调，表明氯沙坦的肾脏保护机制与CGRP与ET-1的拮抗作用有一定关系。氯沙坦有效地拮抗血管紧张素Ⅱ作用，降低TGF-β的分泌，阻断ET的生理功能，促进CGRP的合成，从而缓解CGRP与ET-1的失衡，降低血压，改善肾脏的血流动力学，减轻肾小球毛细血管收缩，使毛细血管压降低，改善肾小球高滤过状态，从而减少尿蛋白;缓解CGRP与ET-1的失衡，可增强细胞保护，抑制血管平滑肌细胞增殖，从而延缓肾小球硬化和肾功能恶化［6，7］，起到对糖尿病肾病的保护作用。

1 Padilla Be，Cottrell GS，Roosterman D，et al.Endothelin-converting enzyme-1 regulates endosomal sorting of calcitonin receptor-like receptor and beta-arrestins.J Cell Biol，2007，179:981-997.

2 Hashitani H，Lang RJ，Mitsui R，et al.Distinct effects of CGRP on typical and atypical smooth muscle cells involved in generating spontaneous contractions in the mouse renal pelvis.Br J Pharmacol，2009，158:2030-2045.

3 Luo F，Ji N，Zhang S，et al.Changes of endothelin and calcitonin gene-related peptide concentrations in plasma during propofol anesthesia.J Newrosurg Anesthesiol，2009，21:47-50.

4 Wynne BM，Chiao CW，Webb RC.Vascular smooth muscle cell signaling Mechanisms for contraction to AngiotensinⅡand Endothlin-1.J Am Soc Hypertens，2009，3:84-95.

5 Haworth RS，Cuello F，Avkiran M.Regulation by phosphodiesterase isoforms of protein kinase A-mediated attenuation of myocardial protein kinase D activation.Basic Res Cardiol，2011，106:51-63.

6 Edvinsson L.Calcitonin gene-related peptide and migraine.Increases understanding of physiopathology can lead to new drug therapy.Lakartidningen，2010 Dec 15-21:3208-3211.

7 Hofman C，Rosenthal T，Winaver J，et al.Renal and systemic effects of endothelin-1 in diabetic-hypertensive rats.Clin Exp Hypertens，2011，33:444-454.