河北唐山地区乙肝患者血清标志物七项与乙型肝炎病毒 DNA定量的对比研究

张 宝，李世龙，田珊红，李小林，张 燕

(1.唐山市传染病医院检验科,河北 唐山 063000； 2.唐山市人民医院检验科，河北 唐山 063000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是目前流行最广泛，严重危害人类健康的肝炎病毒之一，是主要的肝脏疾病致病因子[1]。现全球约3.5亿乙型肝炎(乙肝)感染患者，其中很大部分分布于发展中国家[2]。我国是HBV感染的最主要高流行区，其中HBV慢性感染者约3000万例[3]。国内关于HBV血清学标志物(HBVm)与HBV DNA定量的对比分析的研究较多，由于乙肝在我国流行呈现地区差异性，河北省内相关研究不多。目前HBV感染的实验室诊断可分为免疫学诊断和核酸诊断。随着核酸技术的不断发展，实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,FQ-PCR)检测技术由于具有快速、高特异性、高敏感性而又价廉的特点已广泛应用于临床实验诊断，为HBV的预防及监测疾病的感染提供了直接依据。目前全国HBVm普遍是五项，俗称乙肝两对半，而本研究是七项，这是本研究的优点之处。本研究主要分析本地区人群感染HBV后其血清学标志物(七项)与HBV DNA定量之间的对比分析，最终为本市的医疗机构开展病原学、流行病学和临床应用研究提供可靠依据，以进一步发掘HBVm的价值和意义。

1 材料与方法

1.1材料 选择2007年7月至2008年1月唐山市传染病医院收治的758例门诊及住院的乙肝患者，男509例，年龄2个月至88岁，平均年龄(36.6±13.2岁)；女249例，年龄1 d至70岁，平均年龄(32.5±13.5)岁。

1.2主要仪器与试剂

1.2.1仪器 酶标仪(迈瑞MR-96A)，洗板机(迈瑞MW-12A)，核酸扩增荧光定量检测仪(Real time PCR System美国ABI Prism 7300)，高速离心机(珠海黑马TLG-16R)，恒温加热器(杭州奥盛K30B)。

1.2.2试剂 HBVm的双抗夹心法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测试剂采购于上海科华生物工程股份有限公司；核酸FQ-PCR检测试剂购自于中山大学达安基因股份有限公司。

1.3试验方法 HBVm七项的检测采用ELISA法，操作及结果判读严格按照上海科华试剂说明书。HBV DNA实时荧光定量检测采用FQ-PCR，操作及结果判读严格按照试剂说明书。

1.4统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计数资料比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1ELISA HBVm七项和FQ-PCR HBV DNA定量检测结果 针对758例患者的血清HBVm七项共检出17种模式，阳性判定标准为HBV DNA 定量≥103拷贝/mL。其中有13种模式均呈现HBV DNA定量的阳性率，以HBVm七项(1，3)阳性率最高，为1.63×108拷贝/mL(表1)。

表1 ELISA HBVm七项和FQ-PCR HBV DNA定量检测结果

1：乙肝病毒表面抗原(HBsAg)；2：乙肝病毒表面抗体(HBsAb)；3：乙肝病毒e抗原(HBeAg)；4：乙肝病毒e抗体(HBeAb)；5：乙肝病毒核心抗体(HBcAb)；6：乙肝病毒前S2抗原(Pre-S2Ag)；7：乙肝病毒前S2抗体(Pre-S2Ab)

2.2HBeAg与 HBV DNA定量的相关性分析 758例标本中，依照HBeAg是否阳性将其分为两组。HBeAg阳性组269例，其中有243例(90.33%)检出HBV DNA定量≥103拷贝/mL，平均数为5.13×107拷贝/mL；HBeAg阴性组489例，其中181例(37.01%)标本检出HBV DNA定量≥103拷贝/mL,平均数为8.37×107拷贝/mL。HBeAg阴性组检出率显著低于HBeAg阳性组(χ2=198.01，P<0.01)。

3 讨 论

目前国内各级医疗机构通过筛查试验ELISA法来检测血清标本中HBV的多种HBVm，简称两对半，该方法具有操作简便易行，可以基本满足临床对于乙肝的诊断需要。而本研究在此基础上更添加了Pre-S2Ag、Pre-S2Ab两项，更大大提高了实验诊断的效力，但还是难以确切地反映乙肝患者体内HBV的复制水平，尤其对于传染病医院来说。不能够满足临床对于某些乙肝患者的确诊，隐匿性乙肝诊断以及不能用来判断乙肝抗病毒药物的疗效监测指标、预后的评价等需求。另外，对于能否准确判定临床输血有无感染、乙肝产妇妊娠方式的选择、器官移植、医务人员的意外割伤等情况时，HBVm七项结合HBV DNA定量可满足以上情况。本研究针对以上情况分析了HBVm七项与HBV DNA 定量之间的关系及采用PQ-PCR技术对于临床应用乙肝抗病毒药物疗效监测的重要性。

本研究结果显示，以HBVm七项(1,3)阳性的患者6例，HBV DNA阳性6例，检出率达100%，血清HBV DNA复制水平最高。HBVm七项(1,3,5)、(1,3,7)和(1,3,5,7)阳性的患者，HBV DNA复制水平相当。乙肝患者血清标本中HBeAg阴性组的HBV DNA定量的检出率显著低于HBeAg阳性组，显示HBeAg与HBV DNA的复制相互关联。血清HBeAg是临床指导抗病毒治疗以及观察疗效的常用指标[4]，在乙肝抗病毒治疗过程中，根据HBeAg的S/CO(信号/临界值)的改变进行随访监测，对于抗病毒疗效判断有重要价值并已常规应用。值得注意的是，本研究仍有27例HBV DNA定量检测结果<103拷贝/mL存在于269例HBeAg阳性标本中，其原因是患者经乙肝抗病毒治疗体内HBV DNA复制被抑制或已消失或已进入非活动期，HBV DNA的半衰期短于HBVm蛋白质。而在此以前体内所产生的HBeAg尚未被完全降解，仍处于较高的滴度，由此形成了所谓的HBV HBeAg与HBV DNA的“时相分离”情况[5]。田珊红等[6]等研究阿德福韦酯联合拉米夫定治疗HBV YMDD(酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸)变异的疗效显示，HBV DNA载量随着治疗时间的延长而下降，到治疗结束时有75%的乙肝患者HBV DNA转阴，59.4%的乙肝患者HBeAg转阴。

本研究在HBVm七项(1,4,5)阳性的131例患者血清中，已检出HBV DNA者为50例(38.17%),但HBeAb的出现并不能代表乙肝患者体内HBV复制停止而无传染性。实际上，仍有一些乙肝患者存在HBV的高度复制，这种情况的出现可能是由于前C区基因变异导致HBeAg

不能形成。故此类乙肝患者仍需要接受抗病毒药物的治疗。临床上为判断这些患者应用乙肝抗病毒药物的疗效，应通过PCR技术来实现HBV DNA定量的检测。此外，由于地区差异或抽样人群的差异造成这一比率与陈俊等[7]研究结果有差异。

本研究在HBVm七项(2,4,5)阳性8例患者的血清中,HBV DNA阳性检出1例；HBVm七项(5)阳性16例患者的血清中,HBV DNA定量≥103拷贝/mL检出2例；HBVm七项(4，5)阳性14例患者的血清中,HBV DNA定量≥103拷贝/mL检出4例,以上几种情况都属于隐匿性HBV感染，需要依赖于高灵敏度的HBV DNA定量检测来诊断。对于肝细胞癌患者、anti-HBc单独阳性和HCV感染者的人群中均有一定数量的隐匿性HBV感染。本研究检测出了2例属于隐匿性HBV感染的脐带血中HBVm(3，5)阳性的刚出生婴儿,未检出HBV DNA复制，值得进一步跟踪分析。

值得关注的是，由于HBVm蛋白的表达晚于HBV DNA的复制，本研究在6例血清HBVm七项全阴性的患者中，检出1例HBV DNA复制呈现中度水平的患者，此类患者可能正处于HBV感染的窗口期[8]。另外，由于通过ELISA法检测HBVm七项的灵敏度明显低于应用PCR技术对HBV DNA定量的检测，更进一步证实了HBV DNA的检出早于HBVm。并且在10例HBVm(2)阳性的患者中，有2例存在HBV DNA的复制，其原因可能是乙肝患者先后感染两种不同基因型的HBV或HBV出现抗病毒药物的耐药而进行变异转换。

综上所述，对于临床乙肝的诊断及输血，器官移植等情况，不能将HBVm七项的检测作为传染性的判断依据[9]，对于HBV DNA定量的检测运用PCR方法可比较准确地反映HBV的复制状况，对临床乙肝患者的诊断、妊娠妇女是否适合哺乳、几种抗病毒药物治疗效果的评价、预后判断具有显著价值，而且对于HBVm七项来判断血液或器官是否具有传染性方面，具有无可比拟的优势。但是据美国食品药品管理局对于血液筛查的核酸检测试剂需对50拷贝/mL含量的标本检出率>95%的要求,需要HBV DNA 定量的测定灵敏度大幅提高。

[1] Clarke B,Bloor S.Molecular genotyping of hepatitis B virus[J].J Clin Virol,2002,25 Suppl 3:S41-S5.

[2] Maynard JE.Hepatitis B:global importance and need for control[J].Vaccine,1990,8 Suppl:S18-S20.

[3] 刘洁.HBV肝外感染的临床研究进展[J].疑难病杂志，2007,6(9):569-571.

[4] 周丽敏.乙肝病毒标志物2431例检测模式汇总及分析[J].临床和实验医学杂志,2012,11(1):65,67.

[5] 施保华.乙肝病毒血清学标志物定量检测的临床应用价值[J].中国实用医药,2011,6(6):120-121.

[6] 田珊红，胡金华，张宝，等.阿德福韦酯联合拉米夫定治疗HBV YMDD变异慢性乙型肝炎疗效分析[J].中国煤炭工业医学杂志，2013,16(1)：7-8.

[7] 陈俊，王晓昌.1006例甘肃省陇东地区HBV患者血清标志物与HBV DNA的对比分析[J].分子诊断与治疗杂志，2011，3(1)：36-38.

[8] Loriot MA,Marcellin P,Bismuth E,etal.Demonstration of hepatitis virus DNA by polymerase chain reaction in the serumliver after xpontaneous or therapeuticauy induced HBeAg to anti-HBe or HBeAg to anti-HBs seroconversin in patients with chronic hepatitis B[J].Hepatology,1992,15(1):32-36.

[9] 尚建中，秦守杰.HBV感染者血清学标志与HBV DNA含量的关系[J].中华实用中西医杂志，2004，17(16)：2423-2425.