羊膜在眼科领域应用的研究进展

冯萧萧(综述)，刘 海(审校)

(云南省第二人民医院眼科中心，昆明 650000)

羊膜从细胞滋养层演化而来，是人类两层胎膜的内层，为人体中最厚的基膜。自1910年，Divis首次把胎膜(羊膜+绒毛膜)用于移植取得成功后，羊膜被广泛用于医学临床研究中。随后，Kim等[1]在化学烧伤模型的角膜表面成功进行羊膜移植，羊膜对重建眼表的作用逐渐引起眼科医师的重视。现今成熟的现代化组织制备技术使羊膜的材料性能得到不断地提高和改善，羊膜的开发和应用也不断向前发展。尤其在眼科的应用中，羊膜不仅局限于作为组织移植材料，也被广泛应用于细胞培养载体、分子生物筛、膜控释药系统等基础研究中。

1 羊膜的生物特性

1.1羊膜的组织结构特点 肉眼下羊膜薄而透明。光镜下羊膜自外向内分为5层[2]：上皮细胞层、基膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层。①上皮细胞层：为单层立方上皮，有合成、分泌和沉积基膜和细胞外间质成分的能力。②基膜：由网状纤维构成，含Ⅳ形胶原纤维网，层粘连蛋白和硫肝糖蛋白等。③致密层：由网织纤维组成，与基膜紧密联接，决定了羊膜的张力能力。④纤维母细胞层，由纤维母细胞及网状纤维组成，是组成羊膜厚度的主要部分。⑤海绵层，由波浪状的网状纤维束组成，具有伸展性。电镜下，羊膜上皮细胞外侧面有大量微绒毛结构，上皮细胞间由桥粒和半桥粒相连，形成复杂的迷路型管道系统，基膜上的半桥粒结构非常丰富，含有微纤维[3-4]。目前临床上所用的羊膜植片通常只含有上皮细胞层、基底层和致密层结构。

1.2羊膜的免疫特点

1.2.1羊膜的低抗原性 Adinolfi等[5]研究发现，羊膜不表达人类白细胞抗原Ⅱ(human leucotyte antigenⅡ，HLA-Ⅱ)类抗原，含少量的人类白细胞抗原(HLA-A,B,C)和人类白细胞抗原-DR(HLA-DR)抗原以及B9-微球蛋白，抗原性极低。Kubo等[6]对冻存羊膜的免疫原性进行了研究，发现在异种移植中，羊膜在免疫赦免组织内不引起排斥反应，而在非免疫赦免组织中仅具有相对的免疫原性，同时发现羊膜具有能在体外抑制免疫活性的Fas配体阳性细胞，说明羊膜具有减少免疫细胞来源、避免免疫排斥反应的作用。华萍等[7]通过建立BALB/c小鼠皮下移植实验模型，分析外周血CD3+、CD25+和CD3+、CD21+表达水平及免疫组织化学法定量监测组织切片中CD3+、CD4+、CD8+、主要组织相容性复合体Ⅱ的表达水平，得出冻干羊膜和新鲜羊膜行体内移植后，均表现出极低的免疫原性，不会引起由T细胞介导的特异性排斥反应，具有良好的组织相容性。

1.2.2羊膜可分泌大量细胞因子 Imakawa等[8]研究发现，羊膜可分泌大量的细胞因子，如表皮生长因子、肝细胞生长因子、角质细胞生长因子、神经营养因子(神经营养素、神经细胞分裂素、成纤维细胞生长因子、胶质源性神经营养因子、胰岛素样生长因子等)、转化生长因子β(转化生长因子β1、转化生长因子β2、转化生长因子β3)、碱性成纤维细胞生长因子等及其相应的信使RNA等成分。Hao等[9]通过反转录PCR和免疫组织化学法发现，羊膜上皮和间质细胞可以表达多种抗血管形成因子和抗炎蛋白，包括白细胞介素1受体、白细胞介素10、内皮抑制素前体蛋白，金属蛋白酶组织抑制因子和血小板反应蛋白1等，这些因子作用于眼部可释放各种抗炎和抗血管因子。

2 羊膜在眼科领域的应用

2.1羊膜手术 在眼科临床中，羊膜主要作为生物基膜进行移植。根据手术目的及所希望达到的治疗效果羊膜手术大致可分为羊膜移植术、羊膜遮盖术及羊膜充填术。羊膜移植术的主要目的是使急性损伤的角膜眼表或缺损的结膜区能够迅速上皮化，如眼表化学性烧伤及眼表热烧伤[10]、Steven-Johnson综合征[11]、神经麻痹性角膜病变[12]和准分子激光屈光性角膜手术后角膜受损[13-14]、眼表肿瘤[15]等。羊膜遮盖术主要应用于治疗睑球粘连[16]等大面积的眼表病变，目的是维持眼表稳定，重建眼表结构；羊膜充填术则多应用于眼肌损伤的修复[17]、非感染性角膜及巩膜的溃疡或穿孔[18]及难治性青光眼术后滤过口的粘连[19]等。

2.2羊膜可作为细胞培养的载体 羊膜上带有活性细胞，并可分泌多种细胞因子，使其成为一种理想的支持细胞生长的载体。Dobrowolski等[20]将羊膜作为载体进行角膜缘上皮细胞的自体培养，并进行移植，初步取得满意效果。Fan等[21]采用去除自身上皮细胞的羊膜基膜作为培养载体，种植非转染人角膜内皮细胞，通过体外培养扩增的方法成功培育出具有活性的角膜内皮细胞株。实验证明，羊膜基膜是角膜内皮细胞生长和移植的良好载体，体外培养的角膜内皮细胞移植有望替代供体角膜移植，具有广阔的应用前景。Akrami等[22]以羊膜作为培养液，体外培养视网膜色素上皮细胞，通过检测多种细胞因子及基因表达，发现羊膜可选择性地作为视网膜色素上皮细胞培养的载体。

2.3羊膜细胞可被体外诱导分化 人羊膜上皮细胞具有干细胞的性质，拥有和胚胎干细胞同样的表面标记蛋白，也拥有Oct-4和Nanog基因，是角膜组织工程的理想“种子细胞”。张仁礼等[23]首先将小鼠胚胎干细胞与人羊膜共培养4～5 d，发现胚胎干细胞分化为表皮细胞样的单层细胞，结果显示，人羊膜组织可在体外诱导分化为表皮样干细胞。Fatimah等[24]将经胰蛋白酶消化后的羊膜上皮细胞种植于含有多种细胞因子及诱导液的培养液中，经连续传代(4代)后发现羊膜上皮细胞具有分化为角膜上皮细胞的潜能。周清等[25]和刘小勇等[26]利用角膜基质作为载体诱导人羊膜上皮细胞分化，得到了在形态结构以及在角膜上皮特异性表面标志蛋白CK3/12的表达上均类似角膜上皮细胞的细胞，表明人羊膜上皮细胞在角膜基质的调控下可向角膜上皮细胞分化。

2.4羊膜可作为眼科药物的缓释药膜 羊膜是一种优良的组织工程材料，Kim等[27]认为羊膜可作为有效的药物释放系统，提高药物在泪液中的质量浓度。蔡明铭等[28]将更昔洛韦与纤维蛋白胶混合后与羊膜黏合，制成更昔洛韦-纤维蛋白胶-羊膜复合物，研究发现不论体内或体外条件下，更昔洛韦-纤维蛋白胶-羊膜复合物均具有良好的缓释特性，可成为治疗病毒性角膜炎的新手段。周文君等[29]将纤维蛋白胶交联羊膜和表皮生长因子/壳聚糖纳米粒复合，构建一种新型的无缝合、可移植同时能有效缓释蛋白药物的复合生物材料(rhEGF/CS-FBAM)，成功应用于眼表创伤修复。李小丹等[30]将两性霉素B脂质体与纤维蛋白胶混合，再与羊膜胶联，制备成两性霉素B脂质体胶联羊膜的药膜。将药膜移植于兔眼表后，研究发现两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜是一种较好的药物缓释系统。

2.5羊膜可与众多生物材料共同构建细胞/支架复合体 王馨[31]将人羊膜上皮细胞层和海绵层去除，将余下羊膜组织与自制的硝酸纤维素膜框架制成羊膜支架。研究发现,所制作的羊膜支架贴合牢固，不会皱缩，可用于细胞的悬浮培养，还可以联合皮肤表皮干细胞进行眼表的重建。齐爱青[32]通过构建大鼠羊膜上皮细胞与胶原海绵复合体，将其移入大鼠视神经损伤模型中，发现复合体能发挥大鼠羊膜上皮细胞与胶原海绵的协同作用，改善视神经轴突再生的局部微环境，增加视网膜节细胞的存活量，促进视神经轴突的再生。Chau等[33]将组织性转谷氨酰胺酶与人羊膜进行交联形成一种新的生物支架，体外研究发现，此种支架不仅能够保持光学透明性，还能允许非免疫反应的新生血管形成，为重建眼表结构提供了新的治疗方法。

3 小 结

羊膜以其复杂的组织学结构，独特的免疫学特性，在眼科领域发挥了重要作用。但目前羊膜的应用仍存在诸多问题，羊膜中各种细胞因子在正常及异常眼各组织中如何发挥作用，如何促进创伤愈合，仍需进一步深入研究。相信随着技术的完善与改进、对生物组织材料研究的进一步发展、对羊膜研究的进一步深入，各种适用于不同生物医学领域的新型生物羊膜产品会研发出来。羊膜的应用在眼科领域的发展会得到更加广泛的体现。

[1] Kim JC,Tseng SC.Transplantation of preserved human amniotic membrane for surface reconstruction in severely damaged rabbits cornea[J].Cornea,1995,14(5):473-484.

[2] Bourne GL.The microscopic anatomy of the human amnion and chorion[J].Am J Obstet Gynecol,1960,79:1070-1073.

[3] Lee SH,Tseng SC.Amniotic membrane transplantation for persistent epithelial defects with ulceration[J].Am J Ophthalmol,1997,123(3):303-312.

[4] 文道源，李舒梅，林卡莉,等.新鲜羊膜冻干羊膜、羊膜细胞外基质的形态研究[J].中国实用眼科杂志,2003,21(10):734-738.

[5] Adinolfi M,Akle CA,Mccoll I.Expression of HLA antigens,beta 2-macroglobulin and enzymes by human amniotic epithelial cells[J].Nature,1982,295(5847):325-327.

[6] Kubo M,Sonoda Y,Muramatsu R,etal.Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental transplantation[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2001,42(7):1539-1546.

[7] 华萍,赵淑娥,赵集帅,等.体内植入羊膜的免疫安全性观察[J].南昌大学学报:医学版,2010,50(9):11-14.

[8] Imakawa K,Ji Y,Yamaguchi H,etal.Co-expression of transforming growth factoe beta and interferor tau during peri-implantation period in the eye[J].Endoctr J,1998,45(4):441-450.

[9] Hao Y,Ma DH,Hwang DG,etal.Identification of antiangiogenic and anti-inflammatory proteins in human amniotic membrane[J].Cornea,2000,19(3):348-352.

[10] Clare G,Suleman H,Bunce C,etal.Amniotic membrane transplantation for acute ocular burns[J].Cochrane Database Syst Rev,2012,9:CD009379.

[11] Ciralsky JB,Sippel KC,Gregory DG.Current ophthalmologic treatment strategies for acute and chronic Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis[J].Curr Opin Ophthalmol,2013,24(4):321-328.

[12] Chen HJ,Pires RT,Tseng SC.Amniotic membrane transplantation for severe neurotrophic corneal ulcers[J].Br J Ophthalmol,2000,84(8):826-833.

[13] Kim TH,Lee DY,Rho JH,etal.Application of newly developed aminiotic membrane ointment for photorefractive keratectomy in rabbits[J],Ophthalmic Res,2006,38(2):58-61.

[14] Lee ES,Lee HK,Cristol SM,etal.Aminiotic membrane as a biologic pressure patch for treating epithelial in growth under a damaged laser in situ keratomileusis flap[J].Cataract Refract Surg,2006,32(1):162-165.

[15] Asoklis RS,Damijonaityte A,Butkiene L,etal.Ocular surface reconstruction using amniotic membrane following excision of conjunctival and limbal tumors[J].Eur J Ophthalmol,2011,21(5):552-558.

[16] Patel AP,Satani DR,Singh S,etal.Application of amniotic membrane transplantation in cases of symblepharon[J].J Indian Med Assoc,2012,110(6):388-389.

[17] Kassem RR,Khodeir MM,Salem M,etal.Effect of cryopreserved amniotic membrane on the development of adhesions and fibrosis after extraocular muscle surgery in rabbits[J].Acta Ophthalmol,2013,91(2):e140-e148.

[18] Iakimenko SA,Buznyk OI,Rymgayllo-Jankowska B.Amniotic membrane transplantation in treatment of persistent corneal ulceration after severe chemical and thermal eye injuries[J].Eur J Ophthalmol,2013,23(4):496-503.

[19] Stavrakas P,Georgopoulos G,Milia M,etal.The use of amniotic membrane in trabeculectomy for the treatment of primary open-angle glaucoma:a prospective study[J].Clin Ophthalmol,2012,6:205-212.

[20] Dobrowolski D,Wylegala E.Application of autologous cultivated corneal epithelium for corneal limbal stem cell insufficiency--short-term results[J].Klin Oczna,2011,113(10/12):346-351.

[21] Fan T,Zhao J,Ma X,etal.Establishment of a continuous untransfected human corneal endothelial cell line and its biocompatibility to denuded amniotic membrane[J].Mol Vis,2011,17:469-480.

[22] Akrami H,Soheili ZS,Sadeghizadeh M,etal.Evaluation of RPE65,CRALBP,VEGF,CD68,and tyrosinase gene expression in human retinal pigment epithelial cells cultured on amniotic membrane[J].Biochem Genet,2011,49(5/6):313-322.

[23] 张仁礼，李海标,黄冰,等.人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化[J].中山医科大学学报,2001,40(5):325-328.

[24] Fatimah SS,Ng SL,Chua KH,etal.Value of human amniotic epithelial cells in tissue engineering for cornea[J].Hum Cell,2010,23(4):141-151.

[25] 周清,杨筱曦,阮余霞,等.人羊膜上皮细胞的诱导分化[J].细胞与分子免疫学杂志,2012,28(5):503-504.

[26] 刘小勇,陈剑,周清,等.人羊膜上皮细胞体外培养重建角膜上皮的实验研究[J].中国病理生理杂志,2012，28(4):689-693.

[27] Kim HS,Sah WJ,Kim YJ,etal.Amniotic membrane,tear film,corneal,and aqueous levels of location in rabbit eyes after amniotic membrane transplantation[J].Conrea,2001,20(6):628-634.

[28] 蔡明铭,赵敏.更昔洛韦-纤维蛋白胶-羊膜复合物的缓释特性[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(3):419-422.

[29] 周文君，赵敏，牟彦.载表皮生长因子/壳聚糖纳米粒纤维蛋白胶胶联羊膜的制备及体外释药评价[J].中国组织工程研究与临床康复，2011,15(34)：6322-6325.

[30] 李小丹,赵敏,赵媛,等.两性霉素B脂质体胶联羊膜药膜的体内外缓释研究[J].第三军医大学学报,2010,32(10):1043-1046.

[31] 王馨.羊膜生物支架与组织工程化角膜上皮的构建[D].西安：西北农林科技大学,2004.

[32] 齐爱青.大鼠羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的构建及其对受损视神经的作用[D].上海：第二军医大学,2012.

[33] Chau DY,Brown SV,Mather ML,etal.Tissue transglutaminase (TG-2) modified amniotic membrane:a novel scaffold for biomedical applications[J].Biomed Mater,2012,7(4):045011.

[35] 郝玉华，马景学，修贺明.羊膜均浆治疗实验性孔源性视网膜脱离[J].中华眼底病杂志,2009,25(1):47-50.

[36] Hamilton RD,Leach L.Isolation and properties of an in vitro human outer blood-retinal barrier model[J].Methods Mol Biol,2011,686:401-416.