体外培养大鼠心肌微血管内皮细胞缺氧模型的建立1）

马培泽，宋宪波，刘 宁，姜月华，戴国华

缺血性心脏病已成为威胁人类生命健康的主要杀手，而心肌微血管内皮细胞（CMECs）功能障碍一直是缺血性心脏病病因、发病机制及其防治研究领域中的热点［1］。在体CMECs的功能受多种因素的影响，而体外培养的CMECs能否耐受缺氧，以及缺氧对CMECs活力及凋亡的影响还未明确。本研究通过大鼠CMECs培养，建立体外缺氧CMECs模型，观察了缺氧对大鼠CMECs活力及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康SPF级雄性SD大鼠，山东中医药大学实验动物中心，SCXK（鲁）2011 0003，体重220 g～280 g，普通基础饲料饲喂。

1.2 主要仪器 倒置相差显微镜（德国Zeiss公司），CO2培养箱（美国Heraeus公司），三气培养箱（美国an eppendorf公司），流式细胞仪（德国BECKMAN公司），低温高速离心机（美国Thermo Scientific公司），酶联免疫检测仪（美国BIO-TEK公司）。

1.3 主要试剂 DMEM高糖培养基（美国Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（北京Solarbio公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），PBS平衡液（上海碧云天生物技术有限公司），噻唑蓝（MTT，北京Solarbio公司），二甲基亚枫（DMSO，美国Amresco公司），Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（杭州联科生物有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 大鼠CMECs培养和鉴定 组织植块法［2］。选用雄性SD大鼠，10%水合氯醛0.3 m L／100 g腹腔注射麻醉，75%乙醇浸泡消毒5 min。开胸、无菌剪下心脏，置于无菌培养皿中，去除大血管、左右心房、右心室、室间隔，眼科剪剪碎约2 mm3，滴加1 mL胎牛血清，均匀接种于2个培养瓶中，置37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞孵育箱培养4 h让组织块贴牢，追加2 m L含20%胎牛血清的DMEM高糖培养基，24 h后换液一次，培养72 h左右组织块周围有大量细胞长出，去除组织块，继续培养，3 d换液一次。免疫细胞化学SABC法检测Ⅷ因子相关抗原、CD31抗体免疫染色。胞浆中呈棕色着色，胞膜呈现黄褐色颗粒，表明培养的细胞为 CMECs［3］。

1.4.2 体外缺氧CMECs模型建立 将原代培养的CMECs进行无血清处理12 h以使细胞同步化，然后继续置于无血清培养液中，在1%O2-94%N2-5%CO2低氧气体环境中培养24 h制备低氧损伤模型。

1.4.3 实验分组 低氧气体环境中培养24 h的CMECs作为缺氧组（L组），以无血清常氧培养CMECs作为对照组（N组）。

1.4.4 倒置相差显微镜观察细胞形态 倒置相差显微镜100倍视野下观察缺氧前后CMECs形态变化及贴壁情况。

1.4.5 MTT比色法检测细胞活力 两组CMECs分别用含10%胎牛血清的培养液重悬，制成单细胞悬液，按每孔4 000个接种于2个96孔板中，每孔体积200 L，每组设6个复孔，并设置对照孔，加同等体积培养液，向每孔加入 MTT溶液（5 g／L）20 L，37℃继续孵育4 h，终止培养。吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 L DMSO，振荡10 min，酶联免疫检测仪于490 nm波长测定吸光度。

1.4.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 0.25%胰酶分别消化收集两组细胞，将每个样本细胞数调整为1～5×106个，1 000／min离心5 min，弃上清，PBS洗涤2次，1 000／min离心5 min，弃上清，每个样本用约500μL的1×Binding Buffer重悬细胞；每个样本中分别加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的PI；避光摇均后黑暗中室温孵育5 min；1 h内上流式细胞仪检测分析结果，总凋亡率为早期凋亡与晚期凋亡之和。

1.4.7 统计学处理 采用SPSS 17.0软件分析。计量资料以均数±标准差±s）表示；两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠CMECs的形态观察 倒置相差显微镜下，细胞刚从组织块游离出密度较低时呈星形或多边形（见图1A），当细胞生长至亚融合状态，接近铺满培养瓶底壁时，呈短梭形并呈铺路石状生长（见图1B），在部分区域可见管腔样（见图1C）或血管网络状结构（见图1D）。表明培养的细胞具备微血管内皮细胞特征。

图1 CMECs形态学特征

2.2 Ⅷ因子、CD31相关抗原免疫细胞化学染色鉴定 免疫细胞化学染色显示，第Ⅷ因子相关抗原染色后，胞浆中呈棕色着色，核周染色最强（见图2A）。CD31相关抗原免疫染色后，显微镜下可见内皮细胞胞膜呈现黄褐色颗粒（见图2B），阴性对照组未显色（见图2C）。证明所培养的细胞为微血管内皮细胞。

图2 免疫细胞化学鉴定

2.3 倒置相差显微镜观察缺氧前后细胞形态 与缺氧前相比，缺氧后细胞形态未见明显改变，细胞贴壁良好，很少有漂浮细胞。

2.4 缺氧对CMECs活力的影响 L组CMECs活力（0.53±0.025），N组CMECs活力（0.46±0.055），与 N 组比较，L组CMECs活力明显增加（P＜0.05）。详见表1。

2.5 缺氧对CMECs凋亡的影响 流式细胞仪检测主要将每组测试细胞群区分为四个细胞亚群：左下象限Annexin V-FITC和PI染色均为阴性（即FITC-／PI-），代表正常细胞；左上象限PI单染（即FITC-／PI＋）代表坏死细胞；晚期凋亡坏死的细胞表现为右上象限Annexin V-FITC和PI染色均阳性（即FITC＋／PI＋）；右下象限 Annexin V-FITC单染阳性（即FITC＋／PI-），为早期凋亡的细胞。本实验分析的是早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡率。与N组相比，L组总凋亡率降低（P＜0．05），其中早期凋亡降低最明显（P＜0.01）。详见表1，见图3。

表1 大鼠CMECs活力、细胞凋亡率（x±s） %

图3 流式细胞仪检测细胞凋亡

3 讨 论

随着缺血性心脏病发病率的升高，CMECs缺氧模型的体外培养也越来越受到学者的关注，但是以往的研究大多围绕CMECs缺氧复氧模型展开，单纯缺氧对CMECs的影响未见报道。本研究采用无血清培养液处理CMECs，置于三气培养箱中，制作1%O2-94%N2-5%CO2低氧气体环境，培养24 h成功制备了CMECs缺氧模型。三气培养箱能够通过控制氧气和氮气的输入量，用传感器来实现对氧含量的控制，进行O2、N2和CO2三气控制，达到供氧减少的目的。该模型控制精确，可以设定不同的缺氧程度，而且由于进气装置有过滤膜，不易污染，是目前国际公认的制作细胞缺氧模型设备［4］。

在形态学上细胞核的形态变化为凋亡最典型的特征，也是判断凋亡的最基本、最直接的指标之一［5］。对CMECs而言，形态学变化包括胞膜回缩、漂浮等表现。本研究镜下观察缺氧24 h对细胞形态没有明显影响，但是通过MTT测定细胞活力发现缺氧24 h CMECs活力明显高于常氧组，表明CMECs能够耐受短时间缺氧，这与刘健等［6］的研究结果一致，其研究发现缺氧24 h使肺动脉内皮细胞活力增加，并认为其机制可能是缺氧通过代偿引起线粒体增多，线粒体脱氢酶类活性增加所致。流式细胞仪检测结果发现，缺氧组细胞凋亡率较常氧组细胞明显降低，并且以早期凋亡减少为主。这与缺氧复氧CMECs活力及凋亡检测的研究结果相反，CMECs缺氧复氧后细胞活力降低，凋亡增加［7］。本研究结果的原因可能是缺氧后改变了CMECs增殖相关蛋白激酶和细胞凋亡相关分子的表达，从而调节其细胞活力和凋亡，而缺氧复氧对细胞的损伤较单纯缺氧更为严重。虽然本实验结果发现缺氧后CMECs活力增加，凋亡减少，但是反映其血管生成功能的增殖、迁移、成管的能力还未明确，有待进一步观察。

此外，本实验仅观察了缺氧24 h对CMECs的影响，随着缺氧时间的延长，CMECs活力及凋亡会发生怎样的变化，目前还未明确；单纯缺氧与缺氧复氧对CMECs活力及凋亡影响的区别也有待进一步研究；不同缺氧时间对CMECs增殖与凋亡相关基因和蛋白表达的影响将进一步揭示缺氧状态下CMECs增殖与凋亡的分子机制，随着一系列相关研究的开展，CMECs在缺血性心脏病中的作用将会逐渐明确，并最终为缺血性心脏病的治疗提供新的思路与方法。

［1］ 陈修，陈维洲，曾贵云.心血管药理学［M］.第3版.北京：人民卫生出版社，2002：192.

［2］ 冯兵，何作云，王德文，等.心肌微血管内皮细胞培养及生物学特性的初步观察［J］.微循环学，2000，10：19-21.

［3］ 唐标，曹苏，康焕菊，等.大鼠心肌微血管内皮细胞的体外培养［J］.江苏医药，2010，36：941-942.

［4］ 龚敏，李树清.体外培养细胞缺氧模型及特点［J］.临床合理用药，2011，4：157-158.

［5］ Choi DW，Maulucci GM，Kriegstein AR，et al．Glutamate neurotoxicity in cortical cell cuhure［J］.J Neurosci，1987，7：357-368.

［6］ 刘健，王培勇，罗德成，等.缺氧时体外培养的肺动脉内皮细胞增殖和活力的改变［J］.中国病理生理杂志，1998，14：583-586.

［7］ 张彩峰，张靓，曹苏，等.缺氧-复氧损伤大鼠心肌微血管内皮细胞PI3K、Akt、HIF-1αmRNA的表达［J］.江苏医药，2011，37：1748-1750.