多重PCR快速检测3种食源性致病菌

吴建英，宋建新，曹金萍，涂智杰，余慧宏，胡芹，魏建萍，潘剑

(江西省景德镇市疾病预防控制中心，江西 景德镇333000)

食品中污染的病原菌是引起食源性疾病的主要因素之一。金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aures)、产单核李斯特菌(Listeriamonocytogens)和沙门菌(Salmonella spp)是肉与肉制品、乳与乳制品、水产品、冷冻饮料与饮料、调味品[1]等都需要检测的3种食源性致病菌。目前对这些食源性致病菌的检测，主要还是按照传统的细菌学培养方法，一般需3~7d，操作繁琐，耗时费力[1]。因此急需建立快速有效的检测方法。

本研究通过使用LB培养液进行8h振荡培养增菌与优化多重PCR反应体系，建立一种低廉、高效、简便的多重PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 .1菌株 实验所用菌株共7株，分别为金黄色葡萄球菌 (ATCC29213)、产单核李斯特菌(CMCC54004)、沙门菌(H9812)、志贺菌(ATCC10412)、蜡样芽孢杆菌 (CMCC(B)63303)、大肠埃希菌O157(ATCC43888)、阪崎肠杆菌(ATCC29544)。所有菌株均为本实验室保藏菌株。

1.1 .2培养基 LB培养液组成成份胰蛋白胨10g/L、 酵母提取物 5g/L、NaCl 10g/L， 使用 1mol/L NaOH调pH至7.0。

1.1 .3 试剂及仪器 Taq DNA聚合酶、dNTP、MgCl2、10×PCR buffer、PCR 回 收 试 剂 盒 、DL2000 DNA Marker购于北京天根生化科技有限公司；琼脂糖为西班牙Biowest公司产品；溴化乙锭(EB)为美国Sigma公司产品；引物由上海生工合成。PTC-200 PCR仪为美国MJ公司产品；DYY-6C电泳仪为北京六一仪器厂生产；GelDoc 2000凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司生产；LEGEND MICRO 21Centrifuge高速离心机为美国Thermo Scientific公司生产；FLY-211B恒温摇床。

1.2 方法

1.21 引物设计 根据金黄色葡萄球菌编码耐热核酸酶基因nuc[2]、产单核李斯特菌特异溶血素基因hlyA[3]、沙门菌编码侵染上皮细胞表面蛋白的invA基因[4]设计了3对引物)(表1)。以3种标准菌株DNA为模板 ，PCR扩增后使用PCR回收试剂盒回收扩增片段送至捷瑞公司进行测序验证。

表1 金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌、沙门菌多重PCR反应引物序列

1.2 .2 DNA模板的制备 将7株保藏菌株按照不同组合方式接种于5ml LB培养液中，37℃振荡培养。取菌液100μl置于离心管中，12000r/min离心10min后，弃上清，收集菌体，加1ml 1×TE洗涤1次，然后以50μl 0.5mol/L NaOH悬浮菌体，沸水浴加热5min，迅速冷却后加入50μl 1mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液，充分混匀，12000r/min离心5min，上清即为DNA 模板[5]。

1.2 .3引物特异性实验 以表1的3对引物分别对7株实验菌株的DNA进行PCR扩增以验证引物的特异性。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 30s，进行 35个循环；最后72℃延伸10min。PCR反应体系(20μl):10×PCR buffer 2μl,Mg2+浓度 2.0mmol/L，2.5 mmol/L dNTPs 2.0μl，10 mmol/L 引 物 0.5μl，DNA模板 1μl，5U/μl Taq DNA 聚合酶 0.3μl，加 ddH2O补足20μl。PCR产物检测：取5μl PCR产物加溴酚蓝混匀，以DL2000 Marker作参照，在1.5%琼脂糖凝胶(含 EB 0.5μg/ml)中，100V 电泳，于凝胶成像系统中观察结果。

1.2 .4多重PCR引物浓度的优化

1.2 .4.1 invA引物浓度的优化 PCR反应体系，除了混合DNA模板(金黄色葡萄球菌ATCC29213、沙门菌 H9812、产单核李斯特菌 CMCC54004)1μl，以及 invA 引物浓度 (nmol/L) 分别为 10、20、40、80、160、320和640外，其他物质的含量和PCR的反应条件不变。

1.2 .4.2 hlyA引物浓度的优化 以获得的最佳浓度的 invA 引物与浓度(nmol/L)10、20、40、80、160、320和640的hlyA引物进行双重PCR，确定hlyA引物的最佳浓度。

1.2 .4.3 nuc引物浓度的优化 用最佳浓度invA和hlyA 引物与浓度(nmol/L)10、20、40、80、160、320 和640的nuc引物进行三重PCR，确定nuc引物的最佳浓度。

1.2 .5多重PCR检测LB培养液中的病原菌 将金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌的纯培养物分别、同时或与其他菌(包括志贺菌、大肠埃希菌O157、蜡样芽孢杆菌、阪崎肠杆菌)接种于LB培养液中，混匀。所有菌的接种量均为平均5cfu/ml。采用建立的PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 引物特异性 采用表1的3对引物对7株实验菌株进行PCR扩增，以分析引物的特异性，结果显示，3对引物扩增目的产物测序后与预期结果一致，而且本实验所设计的引物特异性良好。

表2 引物特异性实验结果

2.2 多重PCR引物浓度的确定 按照沙门菌、产单核李斯特菌和金黄色葡萄球菌的顺序对检测基因进行多重PCR的引物浓度进行优化[5]。

2.2.1 invA引物浓度的优化 以金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌的混合DNA为模板，分别对浓度(nmol/L)为 10、20、40、80、160、320 和 640的invA引物进行PCR，结果如图1。当invA引物浓度为40nmol/L(泳道3)时，针对invA基因的扩增条带清晰且无拖尾。因此，本研究采用40 nmol/L的invA引物进行以下实验。

图1 invA引物浓度的优化

2.2 .2 hlyA引物浓度的优化 以金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌的混合DNA为模板，采用40nmol/L的invA引物分别与浓度 (nmol/L)为10、20、40、80、160、320 和 640 的 hlyA 引物组合进行双重PCR，结果如图2。当invA引物浓度为40nmol/L，hlyA 引物浓度为 40nmol/L(泳道 3)和80nmol/L(泳道4)时，能成功地扩增出针对invA和hlyA基因的两条带，且条带清晰，效果好。因此，本研究采用2个组合用于以下实验。

图2 hlyA引物浓度的优化

2.2 .3 nuc引物浓度的优化 以金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌的混合DNA为模板，采用invA引物浓度为40nmol/L和hlyA引物浓度分别为40nmol/L和80nmol/L 2个组合，分别与浓度(nmol/L)为 10、20、40、80、160、320 和 640 的 nuc 引物进行三重PCR，由图3可以看出，当invA、hlyA和nuc的引物浓度(nmol/L)分别为40、40和160(泳道 5)，以及它们的浓度(nmol/L)为 40、80 和 160(泳道12)时，均能扩增出针对上述3个基因清晰的条带。综合上述实验结果，本研究将以invA、hlyA和nuc的引物浓度分别为 40nmol/L、80nmol/L和160nmol/L的浓度组合进行以下多重PCR实验。

2.3 LB培养液中待测菌多重PCR检测 将金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌、沙门菌、干扰菌(志贺菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌O157和阪崎肠杆菌)分别或同时接种到LB培养液中37℃振荡培养8h进行增菌[6]。实验重复3次，提取DNA进行多重PCR检测，结果如图4。从图4可以看出，接种5cfu/ml金黄色葡萄球菌和其他干扰菌仅扩增出132bp的特异性条带；接种5cfu/ml沙门菌和其他干扰菌仅扩增出480bp的特异性条带；接种5cfu/ml产单核李斯特菌和其他干扰菌仅扩增出217bp的特异性条带。同时接种平均5cfu/ml金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌、沙门菌和其他干扰菌后，在泳道上只有3条特异性条带，而没有其他条带，表明多重PCR的特异性好。

注：1~7：invA 和 hlyA 均为 40nmol/L，nuc的引物浓度（nmol/L）分别为 10、20、40、80、160、320 和 640；8~14：invA 和 hlyA 的引物浓度分别为40nmol/L和80nmol/L，nuc引物浓（nmol/L）分别为 10、20、40、80、160、320 和 640；M：DL2000 Marker

图4 接种LB培养液的待测菌多重PCR结果

3 讨论

本研究通过对多重PCR条件的优化，建立了一种能同时检测金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌多重PCR方法。通过文献检索及生物信息学方法选取了金黄色葡萄球菌nuc、产单核李斯特菌hlyA和沙门菌invA的特有基因进行引物设计。为了能够更好的检测本实验所设计的引物的特异性，实验中引入志贺菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌O157、阪崎肠杆菌为干扰菌进行PCR扩增，结果显示，设计的引物具有很好的特异性；通过对扩增产物的回收测序，证明本实验室设计的扩增引物能够达到预期结果。

本实验引物扩增的产物大小分别为nuc127bp、hlyA 217bp,invA480bp，由于产物越大所消耗的PCR反应管内的dNTP消耗就越多，一旦dNTP消耗完毕PCR反应立即停止，因此本实验从大产物的引物浓度开始优化。研究结果表明，扩增产物越大的引物使用浓度越小，可以减少其大量消耗dNTP；而扩增产物较小的引物由于扩增效率高，如果其引物浓度过大，扩增产物大的引物甚至扩增不出产物。因此最终确定以金黄色葡萄球菌nuc基因、产单核李斯特菌hlyA基因和沙门菌invA基因设计引物，浓度分别为160、80和40nmol/L为实验的最佳浓度。

为了验证此种方法检测的灵敏度，本实验室使用LB培养液对金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌、沙门菌、志贺菌、蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌O157和阪崎肠杆菌7种菌采用不同组合方式进行振荡培养增菌，增菌时间为8h。增菌后采用碱煮沸法提取DNA，以金黄色葡萄球菌nuc基因、产单核李斯特菌hlyA基因和沙门菌invA基因设计的特异引物，浓度分别为160、80和40nmol/L时，对其进行扩增，结果显示本实验的检出限为5cfu/ml，而有些相关文献显示能够达到1cfu/ml的检出限，可能是因为其提取方法的不同引起的，但此法具有简单，不需要特殊耗材，整个检测过程少于12h等优点[7]。而传统细菌学方法需要使用不同的增菌液对可疑物进行一次增菌，二次增菌，分离培养，生化反应等一系列繁杂操作才能得出结果。因此多重PCR检测具有简便、快速、经济，具有较好的应用前景。

本研究采用碱煮沸法提取DNA模板，解决了革兰阳性菌在沸水中破壁效果差的问题。由于碱煮沸法对试剂要求简单，并且提取步骤少，很适合基层医疗单位处理食物中毒病原微生物的定性检测。同时采用LB培养液对金黄色葡萄球菌、产单核李斯特菌和沙门菌进行增菌并获得较好的增菌效果。也有人报道称直接从样本中富集菌体进行PCR，这样检测结果假阳性的风险加大，同时不能区分死菌与活菌，而增菌后检测可以解决上述问题。

[1]卫生部:中华人民共和国国家标准，食品微生物学检验[SJ.北京:中国标准出版社,2003

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[3]张晓峰,李爱云,方维焕,等．多重聚合酶链反应鉴别单核细胞增生李斯特菌的研究[J].中华检验医学杂志，2003，26(2)：93-95.

[4]许一平,邵彦春,陈福生,等.沙门菌、 的多重PCR检测[J].微生物学通报,2006,33(6):89-94.

[5]李博,陈福生,王小红,等.多重PCR检测食品中的金黄色葡萄球菌、志贺菌和沙门菌[J].卫生研究，2008,37(4):438-442.

[6]杨平,杨迎伍,陈伟,等.食品中4种致病微生物的多重PCR快速检测技术研究[J].西南大学学报(自然科学版)，2007，29(5)：90-94.

[7]多重PCR/反向线点杂交(RLB)检测细菌性脑膜炎病原体的研究[J].实验与检验医学，2011,29(4)：347-349.