石榴皮提取物对Caco-2细胞生长抑制作用实验

姜 婧，高晓黎，马桂芝，常占英

(兰州军区乌鲁木齐总医院临床医学研究所，乌鲁木齐 830002)

新疆是一个典型的大陆性气候区，有着非常独特的自然生态环境，水土光热资源丰富，蕴育着多样性的生物品种资源，石榴作为新疆的特色林果业在国内外享有盛誉。近年来，随着国内外掀起的石榴研究热潮，石榴的多种功效引起了人们的广泛关注。被人们使用了数个世纪的药材石榴，如今被看作是非常具有潜力的化学预防和抗癌剂，其中抗肿瘤作用研究尤为重视，这说明石榴是一种很有开发前途的天然保健食品。本研究在以往对石榴皮提取物作用的研究基础上，探究石榴皮提取物在体外对Caco-2细胞生长抑制作用，为以后的临床应用研究打下基础。

1 材料与方法

1.1实验细胞株 Caco-2人结肠癌细胞株购自上海中国科学院细胞库。复苏后经培养传至第三代，置于37 ℃、5%CO2的饱和水汽二氧化碳培养箱孵育2～3 d，接种于96孔板。对复苏培养后的肿瘤细胞进行鉴定；肉眼观察细胞形态及色泽；采用细胞计数法在显微镜下鉴定。

1.2石榴皮水提物的制备 称取20 g当季新鲜石榴皮晒干后的粉末，加入240 mL水浸泡后煎30 min，过滤后减压浓缩，浸膏冷冻干燥后得浅黄色至黄褐色粉末，采用不完全高糖DEME (dulbecco′s modified eagle medium)培养基(厂家：Hyclone；批号：NYA0793)溶解，终浓度为1，2，4，8 g/L，分别用P1，P2，P4，P8表示。

1.3用四氮唑蓝比色法测定抑制率 取对数生长期人源性肿瘤细胞，用0.25%胰蛋白酶消化成单层培养细胞，用含10%新生牛血清的roswell park memorial institute(RPMI)1640培养液配成单个细胞悬液，调节细胞浓度为5×107个/L接种于96孔培养板中，每孔体积200 μL。将培养板放入CO2孵箱，在37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养24 h。待大部分细胞贴壁后，将培养好的培养板取出，按照石榴皮水提取物浓度从低到高的顺序，每个浓度设9个孔，同浓度1孔加20 μL提取液，阴性对照采用无药血清，也设9个孔，每孔加20 μL无药血清继续培养。给药24 h后，给每一种浓度提取液培养孔(包括阴性对照的9个孔)加入3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃继续孵育4 h；终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜，振荡10 min，使二甲基亚砜充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸收值，记录结果，按照以下公式计算24 h的细胞增殖抑制率。给药后48、72 h时同样处理，得出48 h和72 h的细胞增殖率，并对抑制率最高的时间组，应用SPSS软件处理数据，Probit回归模式计算出该时间下的IC50值。

2 结 果

2.1肿瘤细胞复苏与鉴定 Caco-2细胞复苏成功，培养后显微镜下观察平板上均有细胞呈多边形单层生长，细胞之间充分伸展相互联系，形成网状结构，符合Caco-2细胞的形态学特征(图1)。

2.2石榴皮提取物对Caco-2细胞的增殖抑制作用结果 经消化传代后，在连续观察的8 d时间内，前4 d Caco-2细胞保持增长态势，在第4日达到细胞数最大值，第5日开始缓慢的负增长。加入石榴皮提取物后，显微镜下可见细胞形态发生改变，部分细胞收缩呈类圆形，有大量致密的颗粒物质聚集于细胞膜下，细胞中部密度显著降低几乎观察不到细胞核。细胞贴壁能力下降，细胞之间的连接减少，细胞与细胞之间几乎不能连接成片而出现空隙(图2)。

图1 Caco-2细胞形态(倒置显微镜，×200)

图2 Caco-2加入8 g/L石榴皮提取物 后显微镜下细胞形态(倒置显微镜，×100)

不同浓度的石榴皮提取物在不同时间对Caco-2细胞增殖的影响，相同浓度下，随着提取物作用时间的延长，对Caco-2细胞的抑制率呈上升趋势，尤其在高浓度时，这种上升趋势越明显，其低浓度提取物抑制率与时间依赖性不十分明显(图3)。相同时间下，不同浓度石榴皮提取物的增殖抑制能力有较为明显的区别，结果表明基本上浓度越高，抑制能力越强(图4)。石榴皮提取物在8 g/L时对Caco-2细胞有较强的抑制作用，24、48、72 h的细胞生长抑制率分别为(50.65±5.18)%、(57.21±2.07)%、(69.88±2.14)%，说明72 h时间内，作用时间越长，抑制率越高；在72 h时不同浓度石榴皮提取物对Caco-2细胞的增殖抑制率均为最高，其IC50为2.89 g/L。

表1 不同浓度石榴皮提取物对Caco-2细胞的增殖抑制作用

图3 石榴皮提取物作用Caco-2细胞后抑制率与时间关系

图4 石榴皮提取物作用Caco-2细胞后抑制率与浓度关系

3 讨 论

新疆石榴为亚热带及温带花果木，喜温暖气候。新疆石榴主要产于南疆的喀什、和田等地区，新疆石榴长期生长在高温、干旱、强光照、沙质土壤条件下，其果实比内地大而皮薄、汁多味甜、营养丰富，集食用、药用和观赏于一体[1-2]。并有不易裂果、存放时间长的特点。据粗略统计，新疆现有石榴种植面积大约2×104km2,石榴产量5×104～6×104吨[3]。主要在和田地区皮山县、喀什地区叶城县和疏附县等地[4]。越来越多的体内外动物模型都证明了石榴预防癌症的作用[5-6]，这些新兴的观点从分子学角度提出了新的研究方向。

关于石榴皮的抗肿瘤作用，有研究表明，石榴皮有显著的抗乳腺癌特性；如果用石榴皮萃取物处理Burkitt淋巴瘤细胞，其细胞周期发生明显变化[7]。石榴皮萃取物还可有效地抑制人类子宫肌层成纤维细胞的增殖[8]。

本研究通过MTT法进行体外石榴皮提取物对Caco-2细胞的生长抑制实验，结果发现不同浓度的石榴皮提取物对Caco-2细胞生长均有抑制作用。本研究只研究了72 h的增殖抑制率影响，发现不同浓度石榴皮提取物的增殖抑制率线性不十分明显，还有待于进一步延长作用时间，提高药物浓度来进行研究。关于石榴皮提取物抑制Caco-2细胞增殖的作用机制，现在研究证明石榴中多酚类物质抑制结肠癌炎症细胞信号[9]，据此推测石榴皮提取物对Caco-2细胞生长抑制作用可能与这些化学物质有关，但有待于进一步研究证明。

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