冻融优质胚胎体外培养时间对临床结局的影响

乜照燕 甄秀丽 张 娜 赵素英 郭丽娜 吕翠婷

河北医科大学第四医院生殖医学科（石家庄，050041）

胚胎的冷冻与复苏是辅助生殖技术（ART）中不可缺少的重要组成部分，影响冻融胚胎移植（FET）临床妊娠的因素较多，包括患者年龄、冷冻胚胎质量、内膜准备方式等，胚胎复苏后和培养时间也是影响因素之一，通常胚胎复苏后培养2～3h即进行移植，随着商品化序贯培养试剂和培养条件的不断改进，延长胚胎体外培养时间成为可能，延长冻融胚胎复苏后体外培养时间是否有助于改善妊娠结局尚有争议。本研究对冷冻胚胎复苏后培养2～4 h移植、＞4～8h移植、＞8h移植的临床结局进行分析，旨在探讨冷冻胚胎复苏后不同体外培养时间对FET周期临床结局的影响。

1 资料和方法

1.1 对象及分组

回顾性分析2011年1月～2012年12月在本院生殖中心进行FET的1061例患者临床资料。纳入标准：移植的胚胎均为新鲜周期获得的优质胚胎经玻璃化冷冻后复苏的优质胚胎（卵裂球≥6个，碎片≤20%，卵裂球大小均匀），子宫内膜厚度8～14 mm。排除标准：存在子宫或盆腔因素者，如子宫腺肌病、黏膜下肌瘤、宫腔粘连、宫腔积液、子宫内膜息肉、子宫内膜增生过长，以及盆腔结核等明确影响子宫内环境因素者。1061例患者中96例冷冻胚胎复苏后培养2～4h移植为A组，615例培养＞4～8h移植为B组，350例培养＞8h移植为C组。

1.2 方法

1.2.1 内膜准备 月经周期正常、有规律排卵的患者采用自然周期，于月经第10天超声监测卵泡发育，当卵泡发育成熟（卵泡平均直径≥17mm）、尿黄体生成素（LH）阳性时，肌注人绒毛膜促性腺激素（hCG ）10 000U，每天超声监测排卵情况，排卵后给予黄体支持，3d后复苏胚胎。排卵不规律、无排卵、月经不规则或多囊卵巢综合征（PCOS）患者用激素替代周期或者来曲唑诱导排卵周期，激素替代者口服戊酸雌二醇 （补佳乐2～8mg／d），内膜厚度≥8mm时，加用孕激素（肌注黄体酮40～60mg／d），3d后复苏胚胎；来曲唑诱导排卵周期，当卵泡发育成熟（卵泡平均直径≥17mm）时，尿LH阳性，肌注hCG 10 000U，每天超声监测排卵情况，排卵后给予黄体支持，3d后复苏胚胎。

1.2.2 胚胎冷冻和复苏 自制封闭式冷冻套管［1，2］，用眼科剪在0.25ml麦管的前端剪出一个斜面，75%乙醇消毒后备用。在室温下，将胚胎移至含7.5%乙二醇、7.5%二甲亚砜、10mg／ml人血清白蛋白（HSA）的人输卵管液（HTF）中平衡5min，最后于含15%乙二醇、15%二甲亚砜、0.6mol／L蔗糖、10mg／ml聚蔗糖（Ficoll）、10mg／ml HSA的HTF中快速清洗至少10次，在体视镜下迅速将胚胎移至已经剪好的0.25ml麦管斜面上。将0.25 ml麦管装于0.5ml麦管内，立即置入液氮并封闭0.5ml麦管，置液氮中保存。胚胎与玻璃化冷冻保护液接触的总时间控制在60s内。

胚胎复苏时从液氮中取出冷冻麦管，从外套管内取出装有胚胎的0.25ml麦管，快速将其从液氮中转移到37℃预热1h的含1.0mol／L蔗糖、10 mg／ml HSA的 HTF中1min，后移至含0.5mol／L蔗糖、0.25mol／L蔗糖溶液中，分别停留3min，最后在含10mg／ml HSA的HTF中平衡5min，移入胚胎培养液并置于培养箱内培养，移植前均行激光辅助孵化。胚胎解冻后完整卵裂球≥50%定义为存活胚胎。胚胎复苏率＝存活胚胎／解冻胚胎×100%。

1.2.3 妊娠判定 移植后常规黄体支持，14d测定血清 －hCG＞10U／L为生化妊娠，2周后行阴道超声检查，提示宫内有孕囊者判定为临床妊娠，3个月后B超随访无胎心搏动者为早期流产。胚胎植入率＝（孕囊数／移植胚胎数）×100%。

1.3 统计学方法

统计学分析采用SPSS13.0软件，计数资料采用卡方检验，多样本率两两比较的卡方分割法，计量资料采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本情况

3组在女方年龄、不孕年限、体重指数、子宫内膜厚度、胚胎复苏率、移植胚胎数等方面无统计学差异（P＞0.05）。见表1。

表1 3组患者基本情况比较

2.2 临床结局

3组患者的胚胎植入率、临床妊娠率、早期流产率、活产率均无统计学差异（P＞0.05），见表2。

表2 冷冻胚胎复苏后不同培养时间临床结局比较（%）

3 讨论

随着ART的发展，胚胎冷冻广泛应用并成为IVF－ET常规技术之一。玻璃化冷冻技术是一种快速冷冻细胞或组织的方法，可避免冻融过程中细胞内冰晶形成，最大限度地降低细胞损伤，具有简单、快捷、冷冻效率高等特点。但冷冻胚胎复苏后培养时间至今尚无共识，不同实验室胚胎培养时间不同，这些差异是否会导致妊娠结局的不同是本研究的目的。

胚胎复苏后通常在体外培养2～3h即行移植。随着胚胎体外培养技术的发展与成熟，胚胎可在体外培养到第5天至囊胚期。将冻融胚胎培养过夜至次日再进行胚胎移植，可从卵裂球是否分裂进一步了解复苏后胚胎发育潜能，从而为FET周期挑选较高植入潜能和发育潜能的胚胎提供参考。有学者认为：冷冻胚胎复苏后延长体外培养时间可以更好地观察胚胎的发育潜能，改善临床结局［3－4］。有研究显示，次日移植并不能提高临床妊娠率和种植率，反而增加流产率［5］。研究结果不尽相同，可能与样本量、患者纳入标准及冷冻胚胎选择标准等有关。另外，也可能与移植时机的选择，即对子宫内膜种植窗与胚胎发育同步性的评估有关。有研究表明，良好的种植环境是胚胎种植成功及临床妊娠的关键，子宫内膜太厚或太薄都可影响胚胎的着床［6］。许多因素影响FET的成功，包括胚胎冷冻时女方的年龄、不孕原因、移植时雌激素水平、子宫内膜厚度、冻存前胚胎形态及胚胎复苏存活率等［7－8］。

本研究选取的对象为近两年在本中心行FET的1061例患者，年龄均＜37岁，排除盆腔手术史，移植的胚胎均为经玻璃化冷冻后复苏的优质胚胎。研究结果显示复苏后胚胎培养不同时间组的胚胎植入率、临床妊娠率、早期流产率、活产率组间均无统计学差异，提示体外延长冻融胚胎培养时间并没有提高FET周期的胚胎植入率和临床妊娠率。冷冻胚胎质量直接影响临床结局，本研究移植的冻融胚胎均为优质胚胎，排除了胚胎质量对临床结局的影响。

综上，对于复苏的优质胚胎，延长胚胎体外培养时间并没有提高FET周期的植入率和临床妊娠率。对于复苏的非优质胚胎，通过延长体外培养胚胎的时间，判断、选择最具有发育潜能的胚胎进行移植，是否能提高临床妊娠率尚需进一步研究。

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