广东凉茶颗粒中芳香酚酸类化学成分研究*

孙彩云, 王志芳, 苏贤君, 雷玲芳, 宋化灿, 张中强, 张翠仙

(1. 河北理工大学 轻工学院，河北 唐山063000；2. 广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006；3. 中国广州分析测试中心广东省分析测试技术公共实验室，广东 广州 510070)

广东凉茶颗粒(王老吉)由岗梅、山芝麻、五指柑、淡竹叶、木蝴蝶、布渣叶、火炭母、金沙藤、广金钱草、金樱根十味中药组成。其味甜、苦，药性寒凉，具有清热解暑，去湿生津之功效。用于四时感冒，发热喉痛，热积滞，口干尿黄。目前除本课题组外，鲜见关于其物质基础的报道[1-2]。为了阐明广东凉茶颗粒的药效物质基础和完善其质量标准，在前期研究的基础上[2]，采用多种现代色谱分离技术：正反相材料(硅胶、ODS、凝胶)、HPLC等继续对其甲醇提取物进行分离，采用现代波谱和物理常数对照等方法鉴定其结构。从中分离得到7个芳香酚酸类化合物(见图1)，化合物1、3、5首次从广东凉茶颗粒中得到。并采用LC-MSn技术对分离得到的单体化合物和已建立LC-MSn指纹图谱进行指认。为进一步建立其质量标准提供参考依据。

图1 从广东凉茶颗粒中分离得到的7种芳香酚酸类化合物Fig.1 Seven structures of compounds 1,2,3,4,5,6,7from Guangdong Liangcha

1 结果与讨论

1.1 化合物结构鉴定

化合物1，无色针状结晶(CHCl3)，θmp210～213 ℃，溴甲酚绿和FeCl3显色反应均呈阳性，说明其为芳香酚酸类化合物。ESI-MSm/z353 [M-H]-结合NMR谱(2-CH2、8-CH和6-C )可确定其分子式为C16H18O9，不饱和度为8。1H NMR谱中低场区出现五组峰信号：δH7.54(1H, d,J=15.5 Hz)，6.25(1H, d,J=16.0 Hz)为反式双键质子信号，7.03(1H, d,J=1.6 Hz)，6.94(1H, dd,J=2.0, 8.2 Hz)，6.76(1H, d,J=8.0 Hz)为1,3,4三取代咖啡酰基类化合物典型特征。13C NMR中δC171.2(s)为羧基碳信号，δC168.7(s)为酯羰基信号。同时高场信号δH5.33 (ddd, 5.5, 4.0, 3.2, 1H, H-3), 4.16 (dd, 10.0, 3.9, 8.0, 1H, H-5), 3.72 (dd, 8.0, 3.0, 1H, H-4), 2.13～2.21 (m, 4H, H-2和H-6)显示结构中存在奎宁酸结构。将1的NMR数据与绿原酸对照[3]，基本一致。确定1为绿原酸。经文献检索发现化合物1首次从广东凉茶颗粒中分离得到。经文献查阅及LC-MSn方法与单味药化学成分对比研究发现，其可能来源于淡竹叶。研究表明此化合物对铜绿假单胞菌具有显著的抑制作用[4]。

化合物2，白色针晶(MeOH)，θmp205～206 ℃，溴甲酚绿和FeCl3反应均呈阳性，说明其为芳香酚酸类化合物。ESI-MSm/z163[M-H]-，结合NMR谱( 6-CH和3-C )确定2分子式为C9H8O3，不饱和度为6。化合物2低场部分NMR数据与1咖啡酰基部分NMR数据基本相似，只是芳香环为1,4对位取代：7.45(2H, d,J=8.4 Hz)，6.81(2H, d,J=8.8 Hz)；同时也存在一个反式双键信息：δH7.60(1H, d,J=15.6 Hz)，6.30(1H, d,J=16.0 Hz)。将2的NMR数据与E-p-coumaric acid对照[5-6]，基本一致。确定2为反式-对香豆酸。经文献检索发现2首次从广东凉茶颗粒中分离得到。经文献查阅及LC-MSn方法与单味药化学成分对比研究发现，其可能来源于布渣叶和淡竹叶。

化合物4：无色针晶，θmp214～216℃，溴甲酚绿反应阳性，表明结构中存在羧基；FeCl3显色反应阳性，表明其含有酚羟基。ESI-MSm/z137 [M-H]-，结合NMR谱( 4-CH和3-C )确定4分子式为C7H6O3，不饱和度为5。1H NMR谱中低场区出现两组峰信号，分别为δH7.88(2H, d,J=8.8 Hz)和6.82(2H, d,J=8.8 Hz)，提示4为1,4对位代芳香类化合物。13C NMR中δC170.2(s)为羧基碳信号，δC163.4(s)、133.1(d)、122.8(s)、116.1(d)也证明了4为1,4二取代芳香类化合物。将4的NMR数据与对羟基苯甲酸的对照[9]，基本一致。故鉴定4为对羟基苯甲酸。经文献查阅及LC-MSn方法与单味药化学成分对比研究发现，其可能来源于布渣叶。

化合物6：无色片状结晶(MeOH-H2O)，θmp134～136 ℃，溴甲酚绿反应阳性，FeCl3显色反应阳性。分子式C8H8O4，ESI-MSm/z167[M-H]-。将6的NMR数据与5对照，二者十分相似，只是6的NMR中明显增加了一个甲氧基信息：δH3.81(1H, s)、δC56.5(q)，羰基的13C NMR信息明显向高场移动(δC=5，δC168.2, s)。将6的NMR数据与原儿茶酸甲酯对照[13]，基本一致。确定6为原儿茶酸甲酯。经文献检索，发现6首次从广东凉茶颗粒中分离得到，并采用LC-MSn方法与单味药化学成分对比研究表明其可能来源于岗梅。

化合物7：无色针状结晶(MeOH)，θmp235～237 ℃，溴甲酚绿反应阳性，FeCl3显色反应阳性。结合ESI-MSm/z169[M-H]-和NMR信息确定其分子式C7H6O5，不饱和度4。将7的NMR数据与4对照，发现1H NMR中仅有一个信号峰且为单峰：δH7.06(s, 2H)，提示该化合物可能为对称的1,3,4,5-四取代芳香化合物。将7的NMR数据与没食子酸对照[14-15]，基本一致。故确定7为没食子酸。进查阅文献和LC-MSn方法与单味药化学成分对比研究发现，其可能来源于金樱根和火炭母。研究表明此化合物具有消除自由基、抗氧化、抑菌等作用[16]。

1.2 指纹图谱色谱峰指认

到目前为止，美国国家食品药品监督局(FDA)、英国草药典、德国药用植物学会、印度草药典和加拿大药用及芳香植物学会等机构均将指纹图谱作为质量控制标准的内容之一。HPLC-MSn指纹图谱是评价中药和中药制剂整体质量的有效有段。根据检测化合物的保留时间和质谱信息，将分离得到芳香酚酸类化合物1,2,3,4,5,7与已建立的广东凉茶颗粒HPLC-MSn指纹图谱[17]进行对照分析(见图2，共已建立98个主要色谱峰)。结果表明(见表1)，只有6个化合物(化合物1,2,3,4,5,7)与已建立HPLC-MSn指纹图谱的色谱峰得以确定。

表1 化合物1,2,3,4,5和7与LC-MSn指纹图谱对照主要信息表[17]Table 1 Comparament information of compounds 1,2,3,4,5 and 7 with the major finger-prints of Guangdong Liangcha by HPLC-ESI-TOF/IT-MS and ESI-TOF-MS in negative ion mode

注“com.”代表“化合物”

图2 由负离子ESI-TOF-MS基峰离子流图获得的广东凉茶颗粒高效液相色谱图[17]Fig.2 HPLC chromatogram of Guangdong Liangcha obtained by BPC of negative-ion ESI-TOF-MS[17]

2 实验部分

2.1 材料与仪器

北京泰克光学仪器厂X-6型熔点仪(熔点未矫正)；旋光由德国POLARTRONIC H H W5 polarimeter(SCHMIDT+ HAENSCH，Germany) 测定；NMR数据由瑞士Bruker 公司AVANCE AV 400和500兆超导核磁共振仪测试；质谱由美国Finnigan公司LCQDECAXP高效液相色谱-质谱联用仪测试完成；1200 HPLC高效液相色谱仪，配备在线脱气机、二元梯度泵、自动进样器和柱温箱(美国Agilent公司)；Agilent Poroshell 120 SB-C18快速分离型高效液相色谱柱(150 mm×2.1 mm，2.7 μm，美国Agilent公司)；6210 TOF质谱仪配备ESI(美国Agilent公司)；旋转蒸发仪(RE2010，巩义市予华仪器有限责任公司)；电子分析天平(AUY120，广州湘仪机电设备有限公司)；凝胶为Sephadex LH-20(日本YMC)；柱层析硅胶(200～300目)为青岛海洋化工有限公司生产。实验用甲醇和乙腈为色谱纯(美国Sigma公司)，甲酸为分析纯(广州化学试剂厂)，实验用水为超纯水，由超纯水设备制备(美国Milipore公司)，其余的溶剂：石油醚、乙酸乙酯、甲醇(分离用)、氯仿等试剂均为广州化学试剂厂产品(分析纯)。

广东凉茶颗粒(广州王老吉药业股份有限公司 批号: 1002037)。

2.2 提取与分离

广东凉茶颗粒(10 kg)，经甲醇渗漉提取，减压回收甲醇，得深黄褐色浸膏(1.18 kg)。浸膏用水捏溶至5回路转L，依次用石油醚(PE)、乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取，萃取液减压浓缩得PE相(5 g)、EtOAc相(51.5 g)、n-BuOH相(188.0 g)和H2O相(500 mL)。

乙酸乙酯部位(51.5 g)进行硅胶(200～300目)柱层析。以极性逐增加的氯仿-甲醇溶剂体系(VPE∶VEtOAc=10∶1, 9∶1, 7∶3, 6∶4，1∶1, 4∶6, 2∶8, 0 ∶100)洗脱。TLC跟踪合并得到8个流分(Fr-1至Fr-8)。流分Fr-1(4.0 g)经硅胶(200～300目)柱层析(VCHCl3∶VMeOH=12∶1, 5∶2)，其中Fr1-1(1.5g)凝胶柱层析(VCHCl3∶VMeOH=1∶1)依次得到化合物3(15 mg)、6(89 mg)、4(50 mg)；流分Fr-1-2(100 mg)硅胶柱层析(VCHCl3∶VMeOH=32∶1)及重结晶得2(4.6 mg)；流分Fr-3经硅胶(200～300目)柱层析(VCHCl3∶VMeOH=7∶1)得Fr3-3(600 mg)；Fr3-3经凝胶柱层析(VCHCl3∶VMeOH=1∶1)依次得1(18 mg)、5(47.5 mg)、4(39.3 mg)、2(2.6 mg)。Fr4(1.5 g)重结晶后得4(794.2 mg)。

正丁醇部位部位(188 g)进行硅胶(200～300目)柱层析。以极性逐增加的氯仿-甲醇溶剂体系(VCHCl3∶VMeOH=9∶1, 8∶2, 7∶3, 6∶4, 5∶5, 4∶6, 3∶7, 0∶1)洗脱。TLC跟踪，得到6个流分(LCDC-1至LCDC-6)。流分LCDC-1(1.5 g)经硅胶(200～300目)柱层析(VCHCl3∶VMeOH=3∶1)，TLC追踪合并得到LCDC-1-2(1.0 g)。LCDC-1-2经凝胶柱层析(VCHCl3∶VMeOH=1∶1)得到7(794.2 mg)；流分LCDC-2(1.5 g)经硅胶(200～300目)柱层析(VCHCl3∶VMeOH=6∶1)，TLC追踪得到LCDC-2-2 (200 mg)，LCDC-2-2经制备型HPLC分离(VMeOH∶VH2O=1∶1)得到2(79 mg)。

2.3 HPLC-MSn指纹图谱确认

2.3.1 对照品溶液的制备 分别精密称取分离纯化所得的绿原酸、反式-对香豆酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸、原儿茶酸甲酯、没食子酸各5.0 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解，定溶，作为对照品溶液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取广东凉茶颗粒10 g (广州王老吉药业股份有限公司，批号为1002037)，置锥形瓶中，100 mL水浸泡过夜，经0.45 (m微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。

2.3.3 样品分析 采用1200 HPLC高效液相色谱仪配备6210 TOF质谱仪分析对照品和供试品的质谱信息，并确定其色谱峰代表的化合物信息。检测条件如下，色谱柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18(150 mm×2.1 mm，2.7μm)；流动相A为φ=0.5%甲酸，B为乙腈，进行梯度洗脱：0～5 min，0% B；5～25 min，φ=0～12% B；25～60 min，φ=12%～20% B；60～90 min，φ=20%～40% B；90～110 min，φ=40%～60% B；110～120 min，φ=60%～95% B，后运行10 min，0 B。流速：0.5 mL/min；进样量：1.0 μL，柱温：25 ℃。质谱仪条件，干燥气体温度：350 ℃，流速：10 L·min-1，喷雾气压：50 psi，毛细管电压：5 000 V，碰撞电压：100 V，挡热电压：65 V，八极射频电压：250 V。

2.4 物理常数及波谱数据

化合物1：无色针状结晶(CHCl3), C16H18O9,θmp210～213 ℃,ESI-MSm/z353[M-H]-;1H NMR (500 MHz, D2O)δH: 7.54(1H, d,J=15.5 Hz, H-7′), 7.03(1H, d,J=1.6 Hz, H-2′), 6.94(1H, dd,J=8.0, 1.6 Hz, H-6′), 6.76(1H, d,J=8.0 Hz, H-5′), 6.25(1H, d,J=16.0 Hz, H-8′), 5.33 (ddd, 5.5, 4.0, 3.2, 1H, H-3), 4.16 (dd, 10.0, 3.9, 8.0, 1H, H-5), 3.72 (dd, 8.0, 3.0, 1H, H-4), 2.13 (m, 2H, H-2或H-6), 2.21(m, 2H, H-2或H-6);13C NMR (125 MHz, D2O)δC: 171.2(C-7, COOH, s), 168.7(C-9′, s), 149.6 (C-4′, s), 147.1(C-3′, s), 146.8(C-7′, d), 127.8(C-1′, s), 123.0(C-6′, d), 116.5 (C-2′, d), 115.3 (C-8′, d), 115.2(C-5′, d), 76.2(C-1, s), 73.5(C-3, d), 72.0(C-4, d), 71.4(C-5, d), 38.8 (C-2, t), 38.2(C-6, t)。

化合物2：白色针晶(MeOH), C9H8O3,θmp205～206 ℃, ESI-MSm/z163 [M-H]-;1H NMR (400 MHz, CD3OD)δH: 7.60(1H, d,J=15.6 Hz, H-7), 7.45(2H, d,J=8.4 Hz, H-2, 6), 6.81(2H, d,J=8.8 Hz, H-3, 5), 6.30(1H,d,J=16.0 Hz, H-8);13C NMR (100 MHz, CD3OD)δC: 171.1 (C-9, s), 161.3(C-4, s), 146.7(C-7, d), 131.2(C-2, 6, d), 127.3(C-1, s), 116.9(C-3, 5, d), 115.7(C-8, d)。

化合物3：淡黄色结晶(MeOH), C9H8O4,θmp188～190 ℃, ESI-MSm/z179[M-H]-;1H NMR (500 MHz, CD3OD)δH: 7.52(1H, d,J=16.0 Hz, H-8), 7.02(1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 6.92(1H, dd,J=2.0, 8.5 Hz, H-6 ), 6.76(1H, d,J=8.5 Hz, H-5), 6.20(1H, d,J=16.0 Hz, H-7);13C NMR (125 MHz, CD3OD)δC: 171.1(C-9, s), 149.5(C-3, s), 147.1(C-4, s), 146.8(C-7, d), 127.8(C-1, s), 123.0(C-8, d), 116.5(C-6, d), 115.5(C-5, d), 15.1(C-2, d)。

化合物4：无色针晶(MeOH), C7H6O3,θmp214～216 ℃, ESI-MSm/z137[M-H]-；1H NMR (400 MHz, CD3OD)δH: 7.88(2H, d,J=8.8 Hz, H-2, 6), 6.82(2H, d,J=8.8 HZ, H-3, 5);13C NMR (100 MHz, CD3OD)δC: 170.2(C-7, s), 163.4 (C-4, s), 133.1 (C-2, 6, d), 122.8(C-1, s), 116.1(C-3, 5, d)。

化合物5：无色针状结晶(MeOH), C7H6O4,θmp199.0～201.0 ℃, ESI-MSm/z153[M-H]-;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 7.44(1H, dd,J=2.0, 8.4 Hz, H-6), 7.42(1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 6.81(1H, d,J=8.6 Hz, H-5);13C NMR (100 MHz, CD3OD)δC: 170.4(C-7, s), 151.6(C-4, s), 146.1(C-3, s), 124.0(C-1, s), 123.2 (C-6, s), 117.8 (C-5, d), 115.9(C-2, d)。

化合物6：无色片状结晶(MeOH-H2O), C8H8O4,θmp134～136 ℃, ESI-MSm/z167[M-H]-;1H NMR (400 MHz, CD3OD)δH: 7.56(1H, br.s, H-2), 7.54(1H, d,J=8.5 Hz, H-6 ),6.84(1H, d,J=8.8 Hz, H-5), 3.81(3H, s, -OCH3);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δC: 168.2 (C-7, s), 152.8 (C-4, s), 148.8(C-3, s), 125.4(C-6, s), 123.3 (C-1, s), 115.9(C-2, d), 114.0(C-5, d), 56.5(C-8, q)。

化合物7：无色针状结晶(MeOH), C7H6O5,θmp235～237℃, ESI-MSm/z169 [M-H]-;1H NMR(400 MHz, CD3OD)δH: 7.06(2H, s, H-2, 6);13C NMR(100 MHz, CD3OD)δC: 170.5(C-7, s), 146.5(C-3, 5, s), 139.7(C-4, s), 122.1(C-1, s), 110.5(C-2, d)。

致谢：感谢11级林秋纯、邓迪和10级杨敏、叶书豪和陈婉文五位同学在化合物分离过程中的实验工作。感谢中山大学分析测试中心姚俊华、关山越老师对化合物结构测试工作的支持。

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