超声激励微泡“空化效应”在肿瘤治疗方面的研究进展*

刘 娟 综述，吴凤林 审校

(南方医科大学南方医院超声诊断科，广州 510515)

目前，随着对微泡造影剂研究的深入，超声激励微泡“空化效应”在疾病治疗中的作用越来越受到重视。所谓超声空化是指存在于液态物质中的微小气泡(空化核)在超声场的作用下被激发，气泡不断地振动、膨胀、收缩乃至崩溃爆裂等一系列的动力学过程[1]。微泡造影剂作为一种人为的空化核，可增加体内空化核的浓度，增强空化效应，并减少产生空化效应所需的超声能量。超声激励微泡“空化效应”可增加细胞膜通透性、增加细胞内药物浓度、介导基因转染、开放组织屏障、栓塞肿瘤滋养血管、促溶栓等，具有安全、靶向、无创的特点，已成为超声医学研究的热点。本文就该技术在肿瘤治疗方面的研究进展及存在的问题综述如下。

1 诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖、侵袭及转移

细胞凋亡是一种凋亡相关基因调控的自身程序化死亡，细胞凋亡失衡与肿瘤发生、发展有密切关系。超声能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的增殖，并且超声联合微泡造影剂能够增强超声诱导肿瘤细胞凋亡的作用，并对肿瘤细胞的侵袭、转移有一定的抑制作用。胡劼等[2]通过体外实验证实，新型多聚体微泡携带舒尼替尼在超声作用下对人肾癌GRC-1细胞生长有明显抑制作用，并诱导细胞凋亡。康娟等[3]报道载多西紫杉醇脂质超声微泡造影剂在超声作用下能延缓兔VX2肝癌的增殖、促进其凋亡，对VX2肝癌具有显著的生长抑制作用。钟华等[1]通过体外实验证实了高机械指数超声造影增强其空化效应能改变微丝、微管的组装和分布，对肿瘤细胞的侵袭、转移有一定的抑制作用。

另有文献报道，低频超声不仅可以通过细胞毒作用直接杀伤肿瘤细胞，而且可以在基因水平改变肿瘤细胞的生物学行为。Sergeeva等[4]从卵巢癌患者腹水中提取卵巢癌肿瘤细胞(MCF-7)接受频率为26.5 kHz的低频超声处理15 s，实验结果显示，处理组卵巢癌细胞出现细胞毒性作用，且细胞增殖率下降显著，而对照组中则未发现。Tabuchi等[5]报道低频超声辐照肿瘤细胞后可以检测到肿瘤细胞193个基因下调和201个基因上调，这些下调基因与细胞生长、增殖和基因表达有关，且与细胞运动、多态性和死亡有关。李蓉等[6]研究表明超声辐照载紫杉醇脂质微泡(PLM)可显著抑制裸鼠SKOV3卵巢癌移植瘤的生长和发展，其机制可能是通过抑制P53抑癌基因的突变，下调了血管内皮生长因子(VEGF)的合成与分泌，破坏并减少肿瘤血管再生，从而抑制肿瘤的生长。该方法的应用为卵巢癌提供了新的临床治疗途径。

2 化疗增敏效应及抵抗肿瘤细胞耐药性

随着对超声波生物学效应的阐明，超声被认为是一种化疗增敏剂[7]，它可协同化疗药物作用，增加肿瘤细胞对化疗的敏感性。有文献报道，高强度聚焦超声(HIFU)治疗后，位于治疗区边缘的肿瘤组织经低剂量超声照射后受到损伤，但未发生坏死，且对化疗药物的敏感性提高了，一些治疗前不敏感的化疗药物于治疗后变得敏感[8]。孙艳辉等[9]验证了低频低剂量超声能有效逆转SKOV3/MDR1细胞株的多药耐药性，其机制与降低细胞膜P-糖蛋白(P-gp)的表达密切相关。该实验采用MTT法检测获得超声(0.3 MHz、1.0 W/cm2)辐照下逆转SKOV3/MDR1多药耐药的最适辐照时间，并采用免疫荧光法检测最适超声辐照前后多药耐药糖蛋白P-gp的表达变化，结果发现40 s为逆转肿瘤细胞多药耐药的最适超声辐照时间，最适辐照有效逆转了SKOV3/MDR1多药耐药性，显著降低了P-gp的表达。

3 增强抗肿瘤免疫力

近年来的研究表明，HIFU技术不仅可以杀死局部肿瘤细胞，还能增强宿主的抗肿瘤免疫力[10]。周颦等[11]采用HIFU肿瘤治疗系统(焦距110 mm、频率0.8 MHz、时间80 s、声强1 054 W/cm2)制备的HIFU瘤苗明显增强了小鼠抗同源肿瘤的免疫力。该实验结果显示，HIFU瘤苗组小鼠肿瘤发生率减低，生存期延长；淋巴细胞在同源肿瘤刺激下增殖明显，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肿瘤细胞有特异性的杀伤，且比高温瘤苗组有更高的增殖率和杀伤率。熊希等[12]报道，相对于聚焦超声一次辐照治疗和假照治疗，聚焦超声二次辐照治疗小鼠宫颈癌U14移植瘤后，对再次接种同种肿瘤的抑瘤率更高，体外脾淋巴细胞对同源肿瘤的杀伤活性更强，机体发挥了更强的特异性抗肿瘤免疫作用。夏纪筑等[13]通过实验观察到HIFU治疗H22移植性肝癌后，活化的CTL细胞能到达同种荷瘤鼠肿瘤局部，并与肿瘤细胞特异性结合，发挥特异性抗肿瘤作用。

HIFU灭活的肿瘤细胞能诱导小鼠产生抗肿瘤免疫力的机制尚不清楚。但研究表明死亡细胞能否激活机体免疫与细胞死亡时某些物质的释放有关，这是一些被称作“危险信号”或“损伤相关分子形式”的物质[14-16]，如热休克蛋白、核苷酸、钙网蛋白等，它们在细胞非正常死亡时释放，作为“危险信号”活化抗原提呈细胞进而激活免疫。文献报道HIFU辐照促使细胞释放腺苷三磷酸(ATP)、乳酸脱氢酶(LDH)、热休克蛋白60(HSP60)等“危险信号”[17]，HIFU毁损的乳腺癌组织也表达HSP70[18]，这可能是HIFU灭活细胞能激活免疫的原因。也有研究指出聚焦超声的热效应、机械效应及空化效应可使胞浆细胞核内的抗原暴露，致细胞膜流动性增加，加深了机体对肿瘤组织的免疫反应或通过改变抗原空间构象，使免疫原性发生改变，从而增强宿主对抗原识别能力[10]。

4 介导肿瘤微血管栓塞或抗肿瘤血管生成

肿瘤的生长及转移依赖于新生血管形成，肿瘤新生血管发育不完全、结构薄弱、通透性高，对各种理化因素的作用比较敏感，这使得采用微泡增强的超声空化效应破坏肿瘤新生血管，从而导致肿瘤缺血、缺氧，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，阻止其向身体其他部位转移成为可能。Gao等[19]报道微泡增强的高压振幅聚焦超声可引起肝脏微血管破裂、出血及肝细胞肿胀等急性微血管损伤，从而短暂性阻断肝脏局部血流灌注。Liu等[20]指出微泡增强的超声空化效应提供了一种新的抗肿瘤血管生成的物理治疗方法，该方法具有很大的潜在临床应用价值。该实验观察到，采用声压为4.8 MPa的高压振幅脉冲式超声联合静脉注射脂质微泡产生空化效应可完全阻断肿瘤微循环达24 h，肿瘤微血管结构遭到破坏，形成弥漫性血肿，并伴随微血栓、细胞间水肿及大量囊泡产生，导致大量肿瘤细胞坏死。Hwang等[21]研究表明微泡造影剂在低频低功率超声辐照下能够破坏血管内皮层,进而导致血栓表面暴露,促使血栓形成活化,此作用限制了特定部位的血流,能够阻断恶性肿瘤组织的血供，引起肿瘤的血管栓塞。

5 介导基因转染、药物传输及肿瘤的靶向治疗

为了最大限度地提高化疗药物对肿瘤组织的杀伤力，降低其毒副作用，近年来对靶向微泡的研究应用非常活跃[22-23]。在超声辅助化疗或靶向治疗时，微泡作为药物载体或与药物混同给药[24]，有助于超声介导、定点治疗，同时微泡还能与其他治疗方法结合。研究表明，微泡在超声作用下产生共振，导致了细胞膜紊乱，从而加强了大分子入胞作用，允许其被转运；微泡击破产生微射流和冲击波反过来引起小孔，这些孔足以使大分子颗粒及基因进入细胞[25]。但也有文献报道质膜形成暂时微孔只适合细胞摄取小分子(<70 kPa)，而细胞摄取大分子(70～500 kPa)的介导主要是通过入胞作用实现的[26]。孔直径范围为30～100 nm，最大的为几微米，它们具有短暂性质，几秒或几分钟后，在Ca2+和ATP的作用下通过内生囊泡修复反应关闭[27]。

基于此，微泡作为化疗药物的载体，在超声作用下使靶细胞膜的通透性暂时增加并且有助于化疗药物进入靶细胞内，增加化疗药物的局部浓度并减少不良反应。张海等[28]自制包裹绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)并携有前列腺癌雄激素受体抗体的聚乳酸/乙醇酸共聚物(polylactic/poly glycolic acid，PLGA)纳米粒(nano polymers，NPs)结合前列腺癌PC4-2细胞，利用超声治疗仪进行体外辐照，结果显示超声辐照对NPs有体外促降解及靶向控释DNA作用，达到靶向抑癌目的。黄品同等[29]通过血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)高表达的结肠癌皮下种植瘤Balb/C裸鼠体内实验，观察到靶向VEGFR2脂质微泡能增强超声空化对结肠癌的治疗效果，且较普通微泡去空化效果更佳。Duvshani-Eshet等[30]运用治疗性超声辐照前列腺癌细胞20 min，使其进行有效转染，并通过体内实验将PEX传输到肿瘤细胞中,结果显示肿瘤细胞的增殖受到抑制并诱导其发生凋亡。Emoto等[31]研究表明,在超声辐射下将携带血管生成抑制剂TNP-470的微泡定位于肿瘤血管内皮细胞上,其抗肿瘤的效果明显增强。廖永玲等[32]通过体内研究证实，超声辐照携带促黄体生成素释放激素类似物的靶向微泡，能显著增强顺铂(DDP)对人卵巢癌耐药细胞A2780/DDP裸鼠腹腔移植瘤的抑制作用，并通过下调基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)表达，降低肿瘤细胞的侵袭、转移能力。

6 展 望

利用超声联合微泡治疗肿瘤还处于实验阶段，仍有较多问题亟待解决:(1)靶向性及稳定性。加强微泡与配体的结合力以及配体与受体之间的结合强度，是微泡具有靶向性的基础。靶向微泡的构建步骤繁琐而费时，其稳定性及体内寻靶效率均有待提高。因此，如何提高微泡载药或基因效率，如何提高微泡在循环中运行的稳定性，如何延长微泡停留在感兴趣区时间，以及如何有效地控制释放时机等是我们需要解决的重要问题。(2)安全性。超声在杀死肿瘤细胞的同时也会对邻近细胞和组织造成伤害。许多体内、外实验表明[33-34]，微泡存在时，经超声照射的组织可出现溶血、微血管渗漏、毛细血管破裂、肌钙蛋白-T增高、心肌损伤，短暂影响左室功能。(3)优化参数。超声辐照参数的优化(包括辐照时间、声频率、强度、占空比、脉冲重复频率、超声波发射方式、超声仪器类型等)；微泡种类、浓度及注射方式的优化等。

虽然超声激励微泡“空化效应”在肿瘤治疗方面的应用仍存在许多问题，但不可否认，该技术的确是一种具有广阔应用前景的无创治疗肿瘤的物理方法，是超声医学领域中发展较快的研究热点之一。随着技术的发展和研究的不断深入，该方法将在临床或基础研究中得到广泛的运用，具有重要的应用价值。

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