新型细胞死亡显像剂18F-FPDuramycin的自动化合成

要少波 胡孔珍 唐刚华 梁 祥 姜申德

1（天津大学 药物科学与技术学院 天津 300072）

2（中山大学附属第一医院 核医学科 广州 510080）

PET技术在临床研究中可用于神经退行性疾病和肿瘤化疗治疗水平的评估，多数化疗药物通过诱发肿瘤细胞死亡（凋亡和坏死）发挥药效[1]。细胞凋亡过程中伴随着多种生理和生化过程[2−3]。因此，越来越多的人开始关注这种基于细胞生理生化变化而检测细胞凋亡的无创伤分子影像技术[4−5]。

耐久霉素(duramycin)是一段含有 19个氨基酸的多肽，可与位于凋亡细胞外翻内膜上的磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)高选择性地结合[6−7]。4-nitrophenyl 2-[18F]fluoropropionate (18FNFP)可作为辅助侧链来标记小分子多肽[8−9]。因此，我们对18F-NFP标记耐久霉素进行了研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Cyclone 10/5（比利时IBA公司），PET-MF-2V-IT-I型氟-18多功能合成模块（北京派特生物有限公司）。氨基聚醚 Kryptofix 2.2.2(K.222)，2-溴丙酸乙酯，无水乙腈(MeCN, 99.9%)，三氟乙酸(TFA)，二（对硝基苯）碳酸酯(NPC)，耐久霉素(duramycin)，二甲基亚砜(DMSO)，二异丙基乙基胺(DIPEA)(美国Sigma-Aldrich公司)。

Sep-Pak light QMA柱、Sep-Pak plus C18柱、Oasis HLB柱(美国Waters公司)。QMA柱的预处理是依次用 NaHCO3（8.4%水溶液）和水冲洗；C18和HLB柱的预处理是依次用乙醇和水冲洗。

1.2 高效液相色谱(HPLC)

在 PET-MF-2V-IT-I合成模块中配备了半制备高效液相色谱(High performance liquid chromatography, HPLC)，半制备HPLC配有反向C18柱(10mm×250 mm；5 mm)、UV 检测器（Alltech 201，UV吸收波长为254 nm）和放射性检测器（北京派特生物有限公司），流动相为乙腈/水（55/45，V/V，含有 0.1% TFA），流速为4 mL·min−1。

分析型高效液相色谱1200系列（美国Agilent公司）；紫外检测器（Agilent interface 35900E，UV吸收波长为254 nm），放射性检测器（美国Bioscan公司），放射性活度计 CRC-25PET（美国 Capintec公司），色谱柱 XDB-C18 (4.6 mm×150 mm，5 mm)。流动相为梯度：0 min，乙腈/水（2/98，V/V，含有0.1% TFA）；8 min，乙腈/水（10/90，V/V，含有0.1% TFA）；20 min，乙腈/水（20/80，V/V，含有0.1% TFA），流速为 1 mL·min−1。

1.3 自动化合成18F-NFP

18F-NFP是一种多用途的辅助基团，常用来标记小分子氨基酸和多肽等带有裸露氨基结构的化合物，在PET-MF-2V-IT-I合成模块上合成的流程示意图(图1)，18F-NFP的合成共需要三步反应(图2)和两个反应瓶，合成模块中各原料瓶和试剂瓶中试剂的布置(表 1)。

图1 18F-FPDuramycin在PET-MF-2V-I合成模块上自动化合成的流程图Fig.1 Schematic diagram of the automated synthesis of 18F-FPDuramycin on the PET-MF-2V-I synthesis module.

表1 放化合成18F-FPDuramycin所需的试剂分别置于PET-MF-2V-I合成模块的不同原料瓶中Table 1 Reagents for the radiosynthesis of 18F-FPDuramycin on the PET-MF-2V-I synthesizer.

图2 18F-NFP和18F-FPDuramycin 的合成路线Fig.2 Synthetic route of 18F-NFP and 18F-FPDuramycin.

回旋加速器(比利时IBA公司)通过18O(p, n)18F核反应生产得到18F负离子，经过QMA柱俘获后用K.222 (1.0 mL, Vial B1)溶液淋洗到反应瓶1中；通氮气(100 mL·min−1)并在 116 °C 加热条件下将液体蒸发至干燥；加入无水乙腈(1.5 mL, Vial B2)，通氮气并加热至116 °C，使残留的水和乙腈共沸以再次除水；将2-溴丙酸乙酯(5 mg, 28mmol)的乙腈溶液(Vial B3)加入至含有活性[18F]KF/K.222的反应管1中，在封闭的反应管中加热至 100 °C并保持10min，我们得到了 2-18F-丙酸乙酯；将 0.2 mol·L−1KOH水溶液(Vial B4)加入至反应管1中，密闭下加热至100 °C并保持10 min，得到2-18F-丙酸钠盐，通氮气并加热至100 °C将液体蒸干，得到了淡黄色的固体粘附于反应瓶底；加入NPC(40 mg, 130 mmol)的乙腈溶液(Vial B5)，密闭下加热至 100 °C保持10min；冷却反应管至室温，向反应瓶中加入5%醋酸水溶液(Vial B6)淬灭反应，充分混匀；将混合溶液转移至瓶B0中，并用半制备HPLC中分离，洗脱条件如方法1中所述；根据18F-NFP放射峰的出峰位置收集流动相于(Vial B10)，瓶中含有0.1% TFA水溶液40 mL，将18F-NFP吸附于HLB柱上；吸附完成后用水1 mL (Vial B11)洗HLB柱；此时的HLB柱通氮气(80 mL·min−1)吹干，用无水乙醚(Vial B12)将18F-NFP从HLB柱上洗下，溶有18F-NFP的乙醚溶液通过硫酸钠柱干燥，转移至反应瓶 2；干燥的乙醚溶液在室温下用氮气吹干，这样我们便得到了高放化纯度的18F-NFP。

1.4 18F-NFP与耐久霉素的偶联反应

将耐久霉素(300 mg)、DMSO(200 mL)和 DIPEA(40 mL)的混合溶液(Vial B7)加入至含有18F-NFP的反应瓶2中，50 ºC加热反应8 min，用5%醋酸水溶液(10 mL, Vial B8)淬灭反应并稀释反应液；将该反应溶液通过C18柱，使18F-FPDuramycin(图2[10])吸附于C18柱上；将吸附于C18柱上的产物用乙醇(2 mL, Vial B9)淋洗，加热至70 ºC用氮气将乙醇吹干，将18F-FPDuramycin与注射用生理盐水配比，并通过无菌 Millipore滤膜(0.22 mm,4 mm)过滤除菌，将溶液导入至无菌瓶(10 mL)备用。

2 结果与讨论

2.1 放化合成

使用PET-MF-2V-IT-I合成模块，以2-溴丙酸乙酯为原料，依次经过亲核氟化、水解和取代三步反应合成了氟标侧链18F-NFP，反应完后用5%醋酸水溶液淬灭，半制备HPLC分离(图3)，氟离子保留时间为220 s，收集产品18F-NFP从760 s开始出峰，880 s结束，接收此范围的HPLC洗脱液并用大量0.1% TFA水溶液稀释后吸附于HLB柱上，乙醚淋洗即可得到高化学和放化纯度(99%)中间体18F-NFP。

图3 半制备HPLC分离18F-NFP的放射峰图谱Fig.3 Semi-preparative of HPLC radioactive chromatogram for purification of 18F-NFP.

随后，将所得18F-NFP在DMSO溶液中DIPEA为缚酸剂，与耐久霉素50 °C下反应8 min，用分析HPLC检测其溶液(图4)。反应液中的各成分经分析HPLC 检测，18F 离子(RT=3.1 min)，2-18F-丙酸(RT=4.2 min)，18F-FPDuramycin (RT=16.5 min)，由于18F-NFP很活泼并且容易在加热条件下水解，反应溶液中副产物较多。之后用酸将反应液淬灭后稀释挂C18柱，并用大量水洗，乙醇洗脱后的溶液再用HPLC分析，出峰位置靠前的18F离子和2-18F-丙酸放射峰已消失，因其极性较大故水溶性较好，很容易被水洗去。

图4 分析HPLC放射图谱(a) 反应液中的放射吸收图谱, (b) 经C18柱纯化后的放射吸收图谱Fig.4 HPLC analysis of radioactive chromatogram.(a) Reaction mixture, (b) Purified 18F-FPDuramycin

对于18F-NFP和duramycin的反应中用到的溶剂和缚酸剂筛选，采用正交试验分析了几种不同溶剂(图5)：乙腈(MeCN)、二甲基亚砜(DMSO)和二甲基甲酰胺(DMF)；且尝试了两种碱：三乙胺(TEA)和二异丙基乙基胺(DIPEA)。结果显示，在 DMSO溶剂中的反应收率最高，并且使用DIPEA作为缚酸剂的总体效果比三乙胺好，最终选择了 DMSODIPEA体系作为18F-NFP和duramycin的反应体系，并以较高和较稳定的收率得到终产物。

图5 影响18F-NFP与duramycin反应收率的因素Fig.5 Influence factors to the yield of reaction.

对18F-NFP和duramycin的反应时间，我们也做了详细的研究，从图6中可以看出，反应收率在起始阶段(2−6 min)处于急速上升期，并于8 min时达到最大值，之后便处于平缓阶段，说明此时已反应完。于是我们选择反应到8 min时加入醋酸水溶液将反应淬灭进行后处理。

图6 反应时间对18F-NFP与duramycin反应收率的影响Fig.6 Relationship between time and yield to the reaction.

该反应过程中需要注意几点，制备得到的18F-NFP吸附于HLB柱上后需要通氮气充分吹干；并且用乙醚洗脱至反应瓶2中，反应瓶温度保持在室温，随后加热吹干，温度不超过40 ºC，18F-NFP非常活泼，较高的温度会导致18F-NFP水解为2-18F丙酸，甚至发生脱氟现象，以致产率降低。18F-NFP与耐久霉素的反应中生成了18F离子和2-18F-丙酸，主要由于反应原料中的含水量所致，18F-NFP在加热条件下很快水解，因此反应前要把原料duramycin用烘箱40 °C中烘干1 h，过高的温度有可能导致多肽的分解变质，经干燥后，18F-NFP和 duramycin反应中的水解产物少了很多。

本方法以18F离子为起始原料，整体合成过程共需120 min，未经衰变矫正的放化收率为(10±5)%(n=8)，终产物18F-FPDuramycin的放化纯度大于99%，比活度(23.7±13.7) GBq·mmol−1(n=10)，该方法为全自动化合成方法，合成过程中无需打开箱体进行操作，可以进行放大量的合成反应。

2.2 质量控制

注射液目测观察为澄清、透明并且无颗粒状物质；pH值的检测是使用pH值2.0−9.0的精密pH试纸来检测，pH值在6.5−7.5；放射性核素纯度是通过检测注射液的半衰期，与已知的18F离子（半衰期为 110 min）作对比而得出结论，经检测其半衰期为(109.5±0.3) min (n=5)；将温度保持在 25 °C 左右，将合成得到的FPDuramycin标准品与带有放射性的产品混合后一同用HPLC分析（方法2），通过比较保留时间而确定化合物的结构(图7)。同时还检测了其放化和化学纯度，放化纯度高于99%，保留时间 RT=16.5 min(图 7(a))；化学纯度大于 98%，HPLC检测保留时间RT=16.9 min(图7(b))。

图7 将18F-FPDuramycin注射液和标准品FPDuramycin混合后进行HPLC分析，所得的放射性图谱(a)和紫外吸收图谱(b)Fig.7 HPLC radioactive (a) and ultraviolet (b) chromatograms of the purified 18F-FPDuramycin solution co-injected with the standard (FPDuramycin).

稳定性实验中，将18F-FPDuramycin注射溶液置于室温保存2 h，用HPLC检测分析（方法2），其放化纯度依然高于95%，显示出了很好的稳定性。毒性试验主要依据中国药典规定进行检测，其检测方法参见文献[11]，经尾静脉注射18F-FPDuramycin(0.5 mL)的小鼠在48 h之内，生长健康，无不良反应和死亡现象，经解剖后各器官未发现损伤。表明该放化药物毒性较低，有望在动物以及人体PET显像中应用。

3 结语

本实验设计了潜在的细胞死亡显像剂18F-FPDuramycin，并成功对其进行了自动化标记合成研究，为18F-FPDuramycin自动化合成提供了较实用的合成工艺，有望进一步在动物实验及人体PET显像中得到应用。但是，18F-FPDuramycin作为潜在的细胞死亡显像剂用于细胞凋亡/细胞死亡相关疾病检测以及肿瘤放化疗治疗效果监测，仍有待研究。

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