流动相对荧光检测器液相色谱仪检定的影响

2014-03-22张国城

计量技术 2014年7期

杨　洋　张国城

(北京市计量检测科学研究院，北京 100029)

0　引言

液相色谱仪荧光检测器是一种高灵敏度检测器，常用于食品、药品等行业中的痕量物质分析。其被检测对象要求具有荧光特性，而物质的荧光特性又受溶剂极性、酸度等因素的影响。JJG 705—2002《液相色谱仪》国家计量检定规程选择硫酸奎宁/高氯酸溶液作为标准物质，对液相色谱仪-荧光检测器的计量指标进行检测，包括仪器的检出限、定性定量重复性等。这是因为硫酸奎宁的荧光产率高，化合物稳定，且吸收光谱和发生光谱重叠小，常作为标准用于计算其他荧光物质的荧光产率。但是大量的计量实践经验表明，如果按规程所选用的85%甲醇/水的流动相进行检测，得到的硫酸奎宁的色谱峰经常不理想，峰形既不对称也不规则，而且伴有一个或多个肩峰，甚至有些仪器在做重复性检测时，峰形不断变化，导致峰面积重复性结果不佳。因此，我们研究了流动相对硫酸奎宁检测结果的影响，发现65%甲醇/水作为流动相效果更好，为广大计量工作者提供有益的参考。

1　流动相对峰形的影响

参照JJG 705—2002检定规程设置仪器相关参数，流速1mL/min，激发波长345nm，发射波长455nm，选择不同比例的甲醇/水做流动性，对1×10-6g/mL的硫酸奎宁进行检测。实验结果表明，如果改变流动相中甲醇和水的比例，色谱峰峰形也会发生变化。以Agilent公司的1260 Infinity仪器(G1321B荧光检测器)为例，检测了甲醇比例由100%、85%、75%变化到65%得到的色谱峰的结果，见图1。在纯甲醇中，硫酸奎宁色谱峰有较长的拖尾(在有些仪器中拖尾由几个肩峰组成)。随着甲醇比例的减少，右侧的肩峰逐渐升高，在75%时变成主峰，到65%时肩峰消失，得到很规则对称的色谱峰。如果甲醇比例降到50%，则色谱峰变窄变高，表现出更好的柱效。

图1　甲醇比例的变化对硫酸奎宁色谱峰的影响

虽然不同厂家和不同型号的荧光检测器，其在相同参数下观察得到的色谱峰形不太相同，但是在甲醇为比例100%～75%，色谱峰形基本在图1中a～c的基础上变化；在65%甲醇/水中，能观察得到类似图1d的规则对称的色谱峰。

2　流动相对峰面积和峰高的影响

流动相对硫酸奎宁色谱峰峰形的影响，将直接影响到色谱峰的峰面积和峰高。以1×10-6g/mL的硫酸奎宁为例，采用C18色谱柱，仪器其他参数参照JJG 705—2002检定规程，进样量为10μL。虽然不同仪器观测得到的结果有所差异，但是变化趋势却是一样的，见表1和表2。规程方法所选择的85%甲醇/水，得到的峰面积和峰高却是最低的。如果各个流动相条件下得到的峰面积与峰高，分别除以85%甲醇/水得到的峰面积和峰高，可以得到不同甲醇比例下的峰面积比和峰高比。随着甲醇比例的进一步降低，峰面积有所变化，但峰高增加更显著，说明峰变得更窄更规则。

表1　流动相对色谱峰参数的影响(Agilent G1321B检测器)

表2　流动相对色谱峰参数的影响(Waters 2475检测器)

3　流动相对检出限的影响

流动相不同，仪器基线噪声变化不显著(假设不变)(本实验Agilent G1321B和Waters 2475检测器观察到的噪声分别为0.0015LU和0.05EU)，但是色谱峰峰高受影响，必然影响仪器的检出限，见表3。可以看出流动相对低浓度硫酸奎宁峰的影响与高浓度情况类似，在65%甲醇/水比例中能得到更好的检出限。

表3　流动相对检出限的影响

4　讨论

4.1　流动相极性对荧光的影响

流动相中甲醇/水比例的影响，可归结为溶剂极性对硫酸奎宁荧光的影响。随着溶剂极性的增加，硫酸奎宁的p →p*跃迁几率增加，荧光强度将增加。随着甲醇比例降低，流动相黏度增加，会减少荧光分子间碰撞机会，使无辐射跃迁几率减少而使荧光强度增强。而且流动相比例的变化，会影响硫酸奎宁形成的氢键，并使硫酸奎宁的电离状态改变，从而改变硫酸奎宁的荧光强度。

4.2　甲醇比例的受限性

甲醇和水混合，在流速相同时，当纯水或纯甲醇时，柱压是最低的，两者混合后，压力会升高，直到两者比例相差不多时，压力最高。以Agilent 1260 Infinity(15cm的C18分离柱，流速1.0ml/min)为例，当甲醇比例由100%、85%、75%变化到65%时，系统压力由8.0MPa、11.6MPa、13.5MPa变化到15.4MPa。当甲醇与水的比例接近1/1时，流动相黏度达到最大(常用于洗针)，柱子压力能达到28.0MPa以上，对柱子损害较大。所以流动相一定要避免使用这个范围的甲醇/水比例。因此进一步降低甲醇比例，虽然能提高硫酸奎宁色谱峰的峰高和对称性，但是会对仪器造成损害，所以65%甲醇/水是比较合适的选择。