5株新分离海洋硅藻总脂和脂肪酸组成的比较研究

高秀芝， 蒋霞敏， 张泽凌， 叶 丽， 孙志鹏

(宁波大学海洋学院 宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室， 浙江 宁波 315211)

微藻作为水域生态系统中重要的初级生产力，具有合成脂肪和多不饱和脂肪酸(PUFA)的能力，且其脂肪不具有鱼腥味，脂肪酸组成较简单，是海洋软体动物、甲壳动物幼体及鱼类仔幼鱼的优良饵料。海洋微藻作为二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等高度不饱和脂肪酸的新来源越来越受到国内外科研工作者的重视。大量研究表明：EPA和DHA在营养强化、预防和治疗多种疾病方面发挥着重要作用，如预防心脏病、动脉粥样硬化，治疗癌症、炎症、哮喘、糖尿病等取得了良好效果[1]。目前日本和美国已利用微藻规模化生产PUFAs，中国利用微藻技术开发PUFAs还处于研究阶段[2]。到目前为止，已测定了上百个品种微藻的脂肪酸。其中研究最多的是三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、中肋骨条藻(Skeletonemacostatum)、小球藻(Chlorellaspp.)等[3]。本实验室从浙江海域采集浮游植物，从中分离微藻，最终筛选出5株硅藻，进行了脂肪含量及脂肪酸组成的比较分析，以期为海洋微藻EPA或DHA的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 水样采集

从浙江渔山列岛、朱家尖海域，采用25号浮游生物网拖采，采集的样品用装有培养基的透明塑料瓶保存，然后带入实验室进行分离。

1.2 微藻的分离

采用平板分离法和水滴分离法对样品中的微藻进行分离。挑选单细胞进行单种培养，藻株大量繁殖后，进一步镜检，反复分离纯化，直至分离出纯藻株，纯种转入100 mL三角瓶中保存培养。

1.3 微藻的培养

用于培养微藻的海水均经脱脂棉过滤、煮沸消毒，所用容器均120℃高温消毒，采用MAV培养基[4]，培养体积5 L，各3平行。培养条件：水温17～25℃，盐度25，自然光照，不充气培养。每天取适量藻液进行计数以确定指数生长期。

1.4 总脂的测定

在藻细胞达到指数生长末期后将藻液离心收集(4000 r/min, 4℃)，冷冻干燥，藻粉于-20℃冷冻保存。称取100 mg左右的藻粉，参照改进后的Bligh-Dyer法[5]进行总脂含量的测定。

1.5 脂肪酸的测定

采用Bligh-Dyer法抽提总脂，分层后下层氯仿层旋转蒸发至恒重，充N2冷冻保存。总脂移入4 mL样品瓶，加入5%～6%KOH甲醇溶液(V/V 4∶1), 充N21 min。皂化甲酯化过程参照文献[6]，然后用日本SHIMADZU公司QP2010气象色谱-质谱分析仪进行分析, 参考脂肪酸标准和参考文献[7-10]，用面积归一法计算出各脂肪酸的百分含量(以占脂肪酸含量的百分比表示)。

1.6 数据处理

试验数据以平均值±标准差来表示，利用Excel 2003和SPSS13.0软件进行数据分析。

2 实验结果

2.1 分离藻株的形态特征

对浙江渔山列岛和朱家尖水样中微藻进行分离、纯化，根据分离纯化过程中培养物的颜色变化和细胞特性的观察，最终筛选出5株易培养、生长稳定的藻株，经鉴定均为硅藻。表1是5株硅藻的形态特征，从表1可以看出这5株硅藻的细胞大小为3.0～23.7 μm。其中大龙骨藻(Tropidoneismaxima)和咖啡双眉藻(Amphoracoffeaeformis)为底栖硅藻，其它3株藻均为浮游硅藻。

表15株海洋微藻的形态特征

2.2 试验条件下5株微藻的生长特性

图1为试验条件下筛选出的5株微藻一次性培养的生长曲线。根据藻类细胞增长的情况，确定曼氏骨条藻SM-2012-1(Skeletonemamunzelii)、曼氏骨条藻SM-2012-2、成对海链藻(Thalassiosirabinata)的指数生长期、相对生长下降期和静止期分别为第3 d、第4 d和第5 d；咖啡双眉藻和大龙骨藻的指数生长期、相对生长下降期和静止期分别为第4 d、第6 d和第8 d。

图1 试验条件下5株微藻生长曲线

2.3 试验条件下5株微藻的生物量

由表2可知，5株微藻中大龙骨藻在培养8 d后生物量最高，为0.204 g/L，其次为咖啡双眉藻(0.179 g/L)>曼氏骨条藻SM-2012-2(0.053 g/L)>曼氏骨条藻SM-2012-1(0.047 g/L)>成对海链藻(0.046 g/L)。

表2 试验条件下5株微藻的藻株干重

2.4 微藻的脂肪含量

表3是5株海洋微藻的总脂含量。结果显示，这5株微藻的收获密度为58×104～197×104cells/mL，曼氏骨条藻SM-2012-2的收获密度最高，咖啡双眉藻最低。5株硅藻的总脂含量为15.14%～28.07%，除成对海链藻外，其它4株硅藻脂肪含量均高于其干重的20%；大龙骨藻总脂含量最高，咖啡双眉藻次之，成对海链藻最低。

表35株海洋微藻的总脂含量

2.5 5株硅藻的脂肪酸组成

5株硅藻的主要脂肪酸为14:0、16:0、16:1 n-7、16:3 n-4、20:5 n-3，占总脂肪酸的67.65%～77.59%。饱和脂肪酸(SFA)含量为24.94%～30.92%，其中成对海链藻的SFA含量最高(30.92%)，其次为曼氏骨条藻SM-2012-1(30.66%)>曼氏骨条藻SM-2012-2(30.18%)>大龙骨藻(27%)>咖啡双眉藻(24.94%)，对于饱和脂肪酸12:0，只有成对海链藻中含有少量，其它4株硅藻未检测到。5株微藻的单不饱和脂肪酸(MUFA)含量为22.74%～30.26%，其中成对海链藻的MUFA含量最高(30.26%)，其次为大龙骨藻(27.21%)>咖啡双眉藻(25.14%)>曼氏骨条藻SM-2012-1(23.90%)>曼氏骨条藻SM-2012-2(22.74%)。5株微藻的n-3 多不饱和脂肪酸(n-3 PUFA)含量为13.27～30.53%，其中曼氏骨条藻SM-2012-2的n-3 PUFA含量最高，咖啡双眉藻最低。5株微藻的n-6 PUFA含量为2.67%～22.63%，其中咖啡双眉藻的n-6 PUFA含量最高，成对海链藻最低。PUFA中 20:5 n-3的含量最高，EPA含量从高到低依次为曼氏骨条藻SM-2012-2(27.74%)>曼氏骨条藻SM-2012-1(24.83%)>大龙骨藻(23.08%)>成对海链藻(22.04%)>咖啡双眉藻(12.72%)。5株微藻富含C16PUFAs，其中16:2 n-4，16:3 n-4是主要的组分，并且16:3 n-4的含量均高于16:2 n-4。5株微藻的C18系列脂肪酸组成各有不同，大龙骨藻的C18系列脂肪酸中18:3 n-6 含量最高(2.74%)，18:1 n-9最低(0.69%)；咖啡双眉藻的C18系列中18:2 n-6最高(1.79%)，而18:1 n-9最低；成对海链藻C18系列脂肪酸中18:1 n-7最高(6.58%)，18:3 n-6最低；曼氏骨条藻SM-2012-1和曼氏骨条藻SM-2012-2的C18系列脂肪酸组成相同，变化趋势相近， C18系列脂肪酸中18:1 n-7含量最高，分别为7.6%、6.28%，18:3 n-3最低，分别为0.32%、0.43%。 5株微藻的20:4 n-6含量为0.12%～17.72%，咖啡双眉藻最高(17.72%)，大龙骨藻其次(5.66%)，曼氏骨条藻SM-2012-1、曼氏骨条藻SM-2012-2、成对海链藻中20:4 n-6的含量极少。 除咖啡双眉藻外，其它4株微藻都含有一定量的DHA。

表4 5株海洋微藻的脂肪酸组成(%占总脂肪酸含量的百分比)

3 讨论

本研究中5株微藻总脂含量为15.14%～28.07%，咖啡双眉藻总脂含量与Chen[7]报道的双凸双眉藻(Amphorabigibba)总脂含量(37.16%)和简单双眉藻(Amphoraexigua)总脂含量(33.21%)有所差异，后者是在水温14～22.5℃，PES培养液中培养49 d后测得，出现此种差异的原因可能是藻株、营养条件、培养时间等不同所致，但可以看出这3株藻的总脂含量都不低，说明咖啡双眉藻相对于其他微藻很可能是含油量偏高的一株藻。曼氏骨条藻SM-2012-1、曼氏骨条藻SM-2012-2的总脂含量与 Rodolfi等[11]的报道中肋骨条藻的总脂含量相近。

5株海洋微藻的主要脂肪酸为14:0、16:0、16:1 n-7、16:3 n-4、20:5 n-3，且16:1 n-7的含量均高于16:0，这与Zhukova等[12]报道的硅藻纲的主要脂肪酸组成相一致。5株微藻的饱和脂肪酸(SFA)含量为24.94%～30.92%，其中曼氏骨条藻SM-2012-1的SFA量(30.66%)与Pistocchi等[13]报道的中肋骨条藻在磷限制的f/2 培养条件下测得的SFA含量(33.8%)接近，而Chen[7]报道的中肋骨条藻的SFA为69.46%，后者的培养时间为49 d，培养液为PES，而有研究表明中肋骨条藻随着培养时间的延长，SFA中的C14:0量增加，EPA降低，因此导致总的SFA增加[12]。Chen[7]报道的简单双眉藻的n-3 PUFA含量(13.45%)与本试验中咖啡双眉藻n-3 PUFA含量(13.27%)的结果相近。5株微藻的n-6 PUFA含量为2.67%～22.63%，而Chen[7]报道的中肋骨条藻的n-6 PUFA为5.92%，后者培养时间为49 d，远长于本试验培养时间，正如前面所述，可能是随着培养时间的延长，多不饱和脂肪酸含量减少所致。本研究中16:1 n-7/16:0为1.2～1.8，Zhukova等[12]研究的三角褐指藻、中肋骨条藻、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、溢缩角毛藻(Chaetocerosconstrictus)4株硅藻的16:1 n-7/16:0为1.3～2.0，两者结果较为接近，且有研究表明16:1 n-7含量高于16:0时具有一定的优势。5株微藻均富含EPA，但不同藻株EPA含量相差很大，一些因素可导致这种差距，例如改变微藻的营养和物理条件，其EPA含量也会从1%～3%增至30%～40%，曼氏骨条藻SM-2012-2的EPA含量(27.74%)与 Pistocchi 等[13]报道的中肋骨条藻EPA含量(26.7%)较为接近，然而脂肪酸组成上的变化，特别是EPA的含量极易受温度、光照及硅酸盐含量的影响，且有研究表明随EPA含量的减少，中肋骨条藻的14:0增加。成对海链藻的EPA含量(22.04%)与Zhukova等[12]报道的海链藻(Thalassiosirasp.)EPA含量(1.75%)和威氏海链藻(Thalassiosiraweissflogii)EPA含量(3.8%)差异显著，导致此差异的原因可能与环境因子及藻株有关。5株微藻的C18系列脂肪酸的含量较低，这与Chuecas等[14]、Volman等[15]、Nichols等[16]对硅藻的研究结果相符合； 5种微藻中咖啡双眉藻的20:4 n-6含量高达17.72%，明显高于Chen[7]报道的简单双眉藻(1.44%)和双凸双眉藻(1.73%)。24:0在文献中未被经常报道[17]，成对海链藻24:0含量(0.11%)与Viso等[17]报道的成对海链藻24:0含量(0.1%)基本一致。

本研究中大龙骨藻和咖啡双眉藻均为底栖硅藻，在本试验条件下培养6 d后达到相对生长下降期，生长周期较其它3株浮游硅藻(4 d)长些；从生物量方面考虑，大龙骨藻培养至相对生长下降期后生物量(0.204 g/L)远高于其它3株浮游硅藻；从总脂方面考虑，也是大龙骨藻最高(28.07%)，其次为咖啡双眉藻(23.58%)、曼氏骨条藻SM-2012-2(22.09%)、曼氏骨条藻SM-2012-1(21.05%)、成对海链藻(15.14%)。从EPA含量来看，曼氏骨条藻SM-2012-2的EPA含量最高，为27.74%，其次为曼氏骨条藻SM-2012-1(24.83%)、大龙骨藻(23.08%)、成对海链藻(22.04%)、咖啡双眉藻(12.72%)。从DHA含量来看，成对海链藻最高(3.45%)，而大龙骨藻、曼氏骨条藻SM-2012-1、曼氏骨条藻SM-2012-2的DHA含量接近，咖啡双眉藻则未检测到DHA。结合咖啡双眉藻的EPA及DHA含量，可先将咖啡双眉藻排除暂不开发的可能性。本研究中收集藻泥时因3株浮游硅藻均易沉降，因此在离心前可先通过虹吸法将藻液浓缩至较少的体积，再离心，方便收集，若在生产上应用，可以大大节约生产成本。

就目前的研究结果而言，筛选出3株具有开发潜能的藻株分别是大龙骨藻、曼氏骨条藻SM-2012-1、曼氏骨条藻SM-2012-2，以期更好的开发利用。需要说明的是，由于5株藻均采用同一营养盐配方和相同理化条件培养，并不一定代表每种藻的最佳优化条件，因此其比较结果存在一定的局限性，这有待于进一步的研究。

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