减数分裂实验材料的优化与染色体制备技术改进

2014-03-22徐根娣陈析丰柯卡茹

生物学杂志 2014年1期

徐根娣, 陈析丰, 柯卡茹

(浙江师范大学化学与生命科学学院，金华 321004)

减数分裂和染色体行为观察是遗传学的经典实验，有利于学生深刻认识遗传学规律和提高教学质量。恰当的选择实验材料，高质量的制片技术，对帮助学生理解减数分裂过程中同源染色体发生配对和分离，非同源染色体重新组合或部分同源染色体间的交换，具有非常重要的意义[1]。减数分裂的动物取材主要是蝗虫。因蝗虫染色体数目较少，染色体较大，并且雄性蝗虫在繁殖季节中处于减数分裂各个时期的细胞多，在实验中容易观察到，因而入选实验教材[2]。但是在实际教学过程中，学生在有限时间内不易找出减数分裂各时期及其对应特征，且制片速度慢，制出的片子效果不好，如有的染色不深或未染上色，甚至观察不到分裂相。因此，根据笔者多年的实践经验，从蝗虫品种、捕捉时间和精细管取材部位来获取分裂相较多的细胞，并结合醋酸洋红染液分步转移染色，提高染色效果，从而提高实验效率和获得较好教学效果。

1 蝗虫精巢材料的筛选

1.1 蝗虫品种和捕捉时间选择

浙江金华的10月—11月份是蝗虫繁殖高峰期，本试验在10月20日到10月30日之间用捕虫网捕捉。为了解一天中是否存在分裂相最旺盛的时段，按早、中、晚3个时间段进行捕捉。早、中、晚时间安排分为早9:30—10:30，中12:30—13:30，晚16:30—17:30。在校园附近操场分别捕捉青脊竹蝗、疣蝗、稻蝗和笨蝗的雄性成体，每个品种8～10只，将虫体的翅膀和后肢剪去，以免飞走，按品种分别放入200 mL烧杯中，扣上盖子备用。

1.2 精巢取材部位的选择

分别选取蝗虫精细管的不同部位进行制片观察，从中筛选出分裂相较多的部位。第1种方法为三段取材法，即蝗虫精细管分为前、中、后3个部分，前段为靠近精细管圆端处，中部为精细管中部，后端为精细管细端处(图1)。第2种方法为二段取材法，即把蝗虫精细管从中部均匀分为2段。

2 材料与方法[3-6]

2.1 解剖材料

对采集来的不同蝗虫品种的雄性个体进行活体解剖。分别将已剪去翅膀和后肢的雄性蝗虫取出，用手术剪去头部，沿虫体胸腹部中间从头部端向尾部端剪开，并撑开已解剖的腹部体壁，用小镊子先将胃肠等器官夹出弃去后，在体壁处可见深黄色的精巢，夹出精巢，放入PBS缓冲液中去除其表面的结缔组织等附着物。然后，换入质量分数为0.25%KCl低渗30 min，使细胞膨胀，利于染色体铺展开来。再转入卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中固定10～24 h，期间换1～2次固定液，充分脱脂。固定结束后，深黄色精巢变成肉眼能见由细管组成的白色精巢，直接放入75%乙醇，并置4℃的冰箱保存。

2.2 制片操作

以往的实验大多采用一次染色法[7]。在本实验中采用不同浓度的醋酸洋红染液分步转移染色。主要步骤：随机选取已固定并保存的蝗虫精巢，按每个品种每个捕捉时间段2只蝗虫精巢的全部精细管制片。取整个精巢于加有0.5%醋酸洋红染液的染色盘中，小心将精细管全部分开，染色10～15 min，然后分别取精细管放于加有1～2滴1%醋酸洋红染液的载玻片中央，用锋利的刀片将细管分成3段或2段，彼此分开，再染色3～5 min，盖上盖玻片，同时覆上吸水纸，压片。压片时左手拇指或食指压住左侧盖玻片以帮助固定，防止盖玻片的滑动，用拇指指腹垂直地用力加压，为使细胞分散，也可用带橡皮头的铅笔，用橡皮头对准材料处轻敲，后拿载玻片对光观察，见标本呈薄雾状即可观察。

2.3 制片观察

将制备好的制片放在显微镜的载物台上，先用低倍镜观察，再用高倍镜，调节显微视野的明暗度进行观察。观察细胞分裂相中不同形态的染色体，根据所学的理论指导，判断出细胞的分裂时期。

3 结果与分析

3.1 蝗虫品种

分别对青脊竹蝗、疣蝗、稻蝗和笨蝗的减数分裂制片进行观察(表1)。结果表明，稻蝗具有分裂相的制片数、2～3个减数分裂时期的制片数、4个以上减数分裂时期的制片数远远高于其它3个蝗虫品种，其次是笨蝗，青脊竹蝗和疣蝗的具有分裂相、2～3个减数分裂时期的制片数和4个以上减数分裂时期的制片数均较少。可见减数分裂实验结果的好坏与蝗虫的品种有关，稻蝗是较好的蝗虫材料。

3.2 蝗虫捕捉时间

为了明确蝗虫的减数分裂是否与蝗虫的时间活动节律有关，选取早(9:30—10:30)、中(12:30—13:30)和晚(16:30—17:30)3个时间段捕获蝗虫。早、中和晚具有分裂相的制片百分数分别为43.2%、43.2%和44.7%，2～3个分裂时期的制片百分数在早、中和晚分别是29.1%、28.9%和30.1%，4个以上分裂在早、中和晚时期的制片百分数为10.2%、10.2%和11.2%。4个品种的蝗虫具有分裂相与减数分裂制片数在3个时间段内接近，可见时间节律并不是影响精母细胞分裂的主要因素。

表1蝗虫减数分裂情况

3.3 取材部位

稻蝗的精细小管后端膨大非常明显(图1A)，而疣蝗的精细小管呈细长状，后端无明显膨大(图1B)。取材时在体视镜下将栉比排列的精细管拨开，三段取材法中选取精细管圆端处和精细管中部膨大明显的精细小管(图1A)，或是二段取材法中选取精细管靠近圆端处，可以观察到有较多的减数分裂相(表2, 图2 A和B)。而后端无明显膨大的精细小管，没压出内容物，处于其分裂相较少或没有(图1B)。因此，选材时应有针对性地挑选后端膨大明显的精细小管(图1A)，使处于分裂相的细胞数目稳定。

图1 稻蝗(A)和疣蝗(B)的精细小管

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图2稻蝗细胞的减数分裂观察(A, B)

Fig 2 The meiosis observation inOxyachinensisThunb (A, B)

4 体会

“减数分裂”既是生物有性生殖过程中的一个重要阶段，也是遗传学三大规律的细胞学基础[8]。针对实验教学中存在的问题，笔者进行了一系列探究，有如下体会：

1) 选材方面，在10月—11月份捕捉稻蝗品种，处于减数分裂相的细胞数目多，可以大大提高实验成功率。在开展减数分裂实验时，在体视镜下将栉比排列的精细小管拨开，有针对性的挑选后端膨大精细小管，挑取其中一条精细小管的后端膨大处(1/2)放在载玻片上观察，使实验结果更为明显。或是取2～3条的精细管小段一起看，注意小段之间分开些，避免压片时的重叠，这样可弥补多个分裂相不能在一张片子上观察到的缺陷。

2) 在实验技术改进方面，本次试验采用醋酸洋红染液分步转移染色，使染色充分，不会出现染色不深及染不上色的现象。在试验中也做过碱性品红与醋酸洋红的比较，前者染色快、深，染色体易观察，但细节不易看清，并且试剂配制要经约2周后才能染色力增强[9, 10]。后者着色较浅，但能看清细节，特别是细胞边界狭隘处，和细胞重叠与否易于区分，后者当天可用，可以更有效地提高染色体的固定效果。因此，选用醋酸洋红染液分步转移染色学生更易观察到明显的实验效果。染色时也可以直接在载玻片上染色，但要注意在染色过程中及时加染液以免材料干燥，如果染液边界出现干燥，观察时要换载玻片，以防影响观片效果。

3) 关于压片，经常有学生由于压片时滑动玻片，导致显微镜下的细胞变形，使实验失败。因此可以用左手拇指或食指压住左侧盖玻片来帮助固定，然后再压片。压片后有时会有细胞重叠现象，一方面可用带橡皮头的铅笔，用橡皮头对准材料处轻敲，使细胞分散；另一方面可以利用显微镜光圈，光照强度等方法来观察细胞边缘，来确定分裂时象。

4)材料保存期1年为佳，虽然2～3年的材料也能观察到分裂相，但时间过长会使精细管收缩，增加操作难度，特别对于学生经验不足，操作不熟练的情况下，影响制片，观察效果大打折扣。