基于DArT标记的三疣梭子蟹地理种群遗传多样性分析

荣晔婧，陈 强，史雨红，陈 炯

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室, 浙江 宁波315211)

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)隶属甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹属(portunus)，是一种重要的大型海产经济蟹类，广泛分布于中国、日本、朝鲜及马来西亚群岛等海域，它具有肉质好、生长快、产量高等优点，经济价值高，养殖利润丰厚，随着海水养殖的快速发展，三疣梭子蟹养殖已成为各沿海地区的主导养殖品种。

目前，三疣梭子蟹养殖业的蟹苗主要还是依靠野生资源，但由于环境恶化、病害和过度捕捞导致野生资源急剧下降，严重限制了养殖业的发展[1]。因此迫切需要对野生资源进行保护，了解三疣梭子蟹的野生种群遗传结构，为开展优良、抗逆品种的选育提供科学依据，保持中国三疣梭子蟹养殖业的持续健康发展。据报道，同工酶[2,3]、16S rRNA、线粒体DNA、COI、CR、ITS1基因片段序列分析[4-6]、随机扩增多态性 DNA (RAPD)[7]、扩增片段长度多态性(AFLP)[8]、微卫星标记(SSR)[1,9,10]等技术均以广泛应用于研究三疣梭子蟹种群内和种群间、或与其它相近物种之间的遗传关系。但上述技术存在检测位点少、筛选周期长、自动化程度低，需已知基因组序列信息等缺点。

多样性芯片技术(diversity arrays technology, DArT)是一种新遗传标记技术，综合了基因芯片、AFLP、PCR、分子克隆等技术[11]，不需已知基因组序列，因此十分适合研究非模式生物[12]。同时，它具有高通量和低成本的显著特点，较好地克服了以往跑电泳凝胶为主的标记技术产量低、成本高、耗时长、自动化程度低以及依赖核酸序列信息等缺点[13]，是一种比较理想的遗传标记技术，已成功应用于水稻、大麦和木薯等多种农作物[11,13-16]和细菌[17]的遗传多样性和种质鉴定研究。本研究先构建三疣梭子蟹基因组代表性DNA文库，从中扩增获得基因组代表性DNA片段，用于点制多样性芯片。再通过杂交获得DArT标记，重新点制多态性富集芯片，通过荧光信号强度转换获得0/1矩阵，从而分析5个三疣梭子蟹地理种群遗传多样性，以期为三疣梭子蟹野生种群保护及选育提供资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

本研究所用5个地理种群的三疣梭子蟹样品，分别取自中国由南到北的5个不同区域：丹东(DD)、烟台(YT)、青岛(QD)、连云港(LYG)、宁波(NB)，分别代表黄海的鸭绿江口种群；渤海的莱州湾种群；会场野生种群；海州湾种群；东海的舟山种群。以上5个种群都于2011年取样，所有样品壳平均长度11.51 cm±1.22 cm，平均体重164.4 g± 19.7 g，雌雄比例1∶1。活体运回实验室，取大螯于-80℃冰箱中保存备用。

大肠杆菌TOP10F’由实验室保存，PstI、TaqI 、T4 DNA连接酶购自Takara公司，氨苄青霉素、X-gal、LB培养基、SSC、1 kb DNA ladder和SDS购自上海生工生物工程公司，DecaLabel DNA Labeling Kit购自Fermatas公司，ExpressHybTM杂交液购自Clontech公司，鲑精DNA购自Sigma公司，Cy3-dCTP和Cy5-dCTP购自GE公司。

1.2 基因组代表性DNA片段文库构建

方法参照Jaccoud等[11]描述。采用酚-氯仿法提取基因组DNA，并将不同地理种群三疣梭子蟹基因组DNA等量混合。100 ng混合基因组DNA用PstI和TaqI进行酶切。在T4 DNA连接酶作用下，纯化的DNA连接上PstI特异性接头(5’-CACGATGGATC CAGTGCA-3’与5’-CTGGATCCATCGTGCA-3’退火而成)。连接产物作为模板用于后续PCR扩增，所用引物为DArT-PstI引物 (5’-GATGGATCCAGTGCAG-3’ )[13]，反应程序如下：94℃变性5 min；94℃ 变性30 s，53℃复性30 s，72℃延伸1 min，72℃延伸反应10 min。扩增产物克隆至载体pMD19-T，转化大肠杆菌TOP10F’并涂布于含氨苄青霉素和X-gal的LB培养基上。

1.3 基因组代表性DNA芯片点制

从基因组代表性DNA文库中随机挑选单菌落，利用质粒载体上的通用引物M13F-47和M13R-48对插入的DNA片段进行PCR扩增，产物用异丙醇沉淀。采用晶芯®SmartArrayerTM48 微阵列芯片点样仪进行芯片点制，同时在芯片上设置一系列阳性和阴性对照。

1.4 芯片杂交和清洗

各地理种群基因组DNA(50 ng)用酶切、加接头、PCR扩增操作如上。各地理种群代表性基因组DNA片段用1倍体积异丙醇浓缩10倍，变性后用DecaLabel DNA Labeling Kit进行Cy3标记，加入含十碱基随机引物的5×缓冲液、MixC、Cy3-dCTP、exo-Klenow fragment共2.1 μL，37℃孵育10 min后，加入dNTPs 0.4 μL，37℃孵育30 min，加入0.1 μL EDTA(pH值8.0)终止反应。参考DNA为pMD19-T载体多克隆位点片段并进行Cy5标记。Cy3和Cy5标记反应产物混合，再加入1 μL鲑精DNA(10 g/L)和50 μL ExpressHybTM杂交液混合后，96℃变性3 min，冰浴骤冷1 min。DArT芯片在紫外交联仪中250 mJ交联备用。杂交反应在晶芯®杂交仪中进行，65℃孵育过夜。杂交后先用0.3× SSC, 0.1% SDS 清洗1次，再用0.06× SSC清洗2次，离心甩干。

1.5 数据提取及处理

杂交后采用晶芯®LuxScanTM10K-A 双通道激光共聚焦扫描仪进行扫描，并用LuxScan3.0 软件进行数据的提取。若对应的参考DNA杂交荧光强度较弱，则属于坏点，弃之。质量符合条件的探针，其对应的荧光强度按照log[cy3target/cy5reference]进行计算并均一化，利用模糊C-均值聚类分析法(模糊度为1.5)及ANOVA获得0或1标记矩阵。最后探针对应的结果必须满足：在90%的芯片中置信水平P>0.95(赋值概率采用聚类算法)；符合前述条件时，在某张芯片上如果P<0.95则标记为缺失(×)。

1.6 5个三疣梭子蟹种群遗传关系分析

1.6.1 多样性芯片(discovery arrays) 在本研究中，首先从随机挑取的2500个基因组代表性DNA文库克隆中扩增候选DArT标记，点制成多样性芯片，每个点重复3次。此外，质控包括探针结合质控、阳性杂交质控、阴性杂交质控、空白。

1.6.2 多态性富集芯片(polymorphism-enriched arrays) 将筛选获得的上述候选DArT标记重新点制成多态性富集芯片，每个点重复3次。芯片共35行、27列，每个DArT标记重复3次，每个点的位置用“行标-列标”表示。其中1-1～1-3为HEX探针结合质控，1-4～1-18为阴性质控，1-19～1-21为阳性质控，1-22～1-27为空白，35-22～35-27为三疣梭子蟹阳性探针。

来自于5个三疣梭子蟹野生种群PstI/TaqI代表性片段与多态性富集DArT芯片杂交，并重复1次。依据上述数据处理原则，获得稳定的0/1矩阵。采用PHYLIP 3.695软件的RESTDIST和NEIGHBOR程序，用Nei/Li方法计算遗传距离并构建非加权组平均法(UPGMA)系统发生树[18]，用SEQBOOT程序进行bootstrap分析，重复次数为1000计算各分支的置信度[19]。

2 结果

2.1 基因组DNA代表性DNA文库构建

本研究中基因组DNA完整，纯度高，无RNA污染(图1A)。将5个三疣梭子蟹地理种群基因组DNA等量混合，PstI和TaqI完全酶切后纯化(图1B)。在T4DNA连接酶作用下，纯化的DNA酶切片段与PstI特异性接头连接。连接产物作为模板进行后续PCR扩增(图1C)。PCR产物克隆至pMD19-T载体后转化大肠杆菌Top10F’，所得基因组DNA代表性DNA文库滴度≥105，阳性克隆平均插入片段长度>500 bp(图1D)，符合DArT芯片点制要求。

A：5个三疣梭子蟹地理种群基因组DNA，M—1 kb DNA ladder；A1—丹东，A2—烟台，A3—青岛，A4—连云港，A5—宁波；B：混合基因组DNAPstI和TaqI酶切检测 (5 μL)；C：加pstI接头后PCR扩增；D：基因组DNA代表性文库插入片段电泳检测结果，1～24—随机选取的克隆。

图1三疣梭子蟹基因组DNA代表性片段文库构建

Fig 1 The construction of genomic representations library

2.2 采用DArT芯片技术分析三疣梭子蟹不同地理种群的亲缘关系

5个三疣梭子蟹地理种群经多样性芯片分型，初步筛选获得313个DArT标记，多态性效率为12.5%。5个三疣梭子蟹地理种群再次与多态性富集芯片杂交，获得稳定的0/1矩阵。数据分析显示Q>71%，call rate>93.5%，不一致性(discordance)<0.01，符合质量标准。

图2采用多态性富集芯片确定5个三疣梭子蟹地理种的群遗传多样性

Fig 2 Identification of genetic diversity of five geographical populations of the swimming crab detected on the polymorphism-enrichedPstI/TaqI arrays

313个候选多态性标记的多态信息含量(polymorphism information content, PIC)介于0.32～0.48，中间值为0.40，较高于随机选择的双等位基因位点的多态信息含量。系统进化树显示了5个三疣梭子蟹地理种群之间的遗传关系，其中青岛和连云港的种群最先成簇，再与宁波种群成簇(图3)，这可能是由于青岛和连云港都属于黄海，宁波位于东海，黄海和东海两个水域之间存在基因交流。

根据313个PstI/TaqI多态性标记构建UPGMA系统树图，分叉处数值表示1000次重复抽样所得到的置信度百分比，只显示置信度50 %以上的数值。

图3 5个三疣梭子蟹地理种群之间的遗传关系

Fig 3 Genetic diversity of five geographical populations of the swimming crab

重复性验证先采用不同生长阶段和不同环境的宁波地区三疣梭子蟹样品制备6份PstI/TaqI代表性片段，每份样品重复杂交1次。这个基因型杂交call rate为98%。重复实验中2次赋值结果一致性为99.1%，绝大部分(96%)DArT标记在不同的样品杂交结果中赋值相同。其余4%在6个样品杂交中结果不同，这可能是由于发育或环境造成了基因组甲基化不同。这些DArT标记显然不适合包含在基因分型芯片中。另外，重复性验证还采用同一样品不同个体的代表性DNA片段进行杂交。3个样品，每个样品2个个体。结果显示，两个个体之间差异在0.7%～1.6%之间，这是个体遗传异质性造成的。

3 讨论

本研究构建的三疣梭子蟹基因组代表性DNA文库滴度≥105，阳性克隆平均插入片段长度>500 bp。多样性芯片包括2500个基因组代表性DNA，作为候选多态性DNA，杂交筛选获得313个DArT标记，多态性效率为12.5%。上述多态性标记重新点制成多态性富集型DArT芯片，杂交显示Q>71%，call rate>93.5%，不一致性(discordance)<0.01，符合质量标准。以0/1矩阵数据格式，分析了5个三疣梭子蟹地理种群间的遗传多样性。

基因组复杂性降低方法决定了基因组代表性文库的多态性效率。PstI和TaqI酶切组合是DArT技术中降低基因组复杂度常用组合，在已报道文献中证明此组合能获得更高的多态性效率[13,16]，本研究中采用该酶切组合构建PstI和TaqI酶切，多态性效率为12.5%。对于遗传变异小的生物，基于PstⅠ的基因组复杂性降低方法构建的基因组代表性文库的多态性效率甚至不到10%，因此改进原有技术或者寻求新的基因组复杂性降低方法，提高文库中差异片段的比例，对于提高DArT技术的效率非常重要[20]。此外，由于PstI是甲基化敏感限制性内切酶[13]，所以基因组甲基化程度也将影响多态性效率。

PIC是DArT技术的一个重要指标。Botsein[21]首先提出了衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，当PIC>0.5时，表明该遗传标记可提供丰富的遗传信息；当0.25

DArT技术已在农作物的遗传多样性分析中得到有效应用[11,13-16]。目前，该技术还尚未在水产动物中应用。三疣梭子蟹地理种群遗传多样性分析主要是形态学方法、CR基因序列分析、SSR分子标记技术。在形态学上，鸭绿江口、莱州湾、海州湾、舟山4个野生种群的三疣梭子蟹中，海州湾、舟山2个种群形态最为接近，鸭绿江口和莱州湾2个种群形态较为接近[23]。冯冰冰等[24]利用线粒体CR基因片段序列分析，表明青岛、连云港、象山遗传距离较近。李晓萍[22]采用SSR标记技术对5个种群(舟山、海州湾、青岛即墨会场、莱州湾、鸭绿江口)的野生三疣梭子蟹的遗传多样性进行了比较分析，结果表明，即墨会场和海州湾两个种群遗传距离最近，莱州湾种群与这4个种群的遗传距离较远。Liu等[1]研究了山东半岛5个地区三疣梭子蟹的遗传结构，表明烟台和青岛遗传距离较远。此外，本研究显示的结果与文献报道一致，说明DArT技术准确地反映了地理种群之间的遗传多样性。

综上所述，本研究报道了一种高通量的DArT技术，可用于三疣梭子蟹遗传多样性分析，可获得稳定并明确的遗传分型图谱，将有助于三疣梭子蟹自然资源遗传多样性研究和开展优良品种选育工作。

参考文献：

[1]Liu Y G, Guo Y H, Hao J, et al. Genetic diversity of swimming crab (Portunustrituberculatus) populations from Shandong peninsula as assessed by microsatellite markers[J]. Biochem Syst Ecol, 2012a, 41:91-97.

[2]王国良, 金 珊, 李 政, 等. 三疣梭子蟹养殖群体同工酶的组织特异性及生化遗传分析[J]. 台湾海峡, 2005, 24(4): 474-480.

[3]余红卫, 朱冬发, 韩宝芹. 三疣梭子蟹不同组织同工酶的分析[J]．动物学杂志, 2005, 40(1): 84-87.

[4]郭天慧, 孔晓喻, 陈四清, 等. 三疣梭子蟹线粒体DNA、16S rRNA和COI基因片段序列的比较研究[J].中国海洋大学学报, 2004, 34(1): 22-28.

[5]Xu Q H, Liu R L, Liu Y. Genetic population structure of the swimming crab,Portunustrituberculatusin the east China sea based on mtDNA 16S rRNA sequences[J]. J Exp Mar Biol Ecol, 2009, 371(2):121-129.

[6]李远宁, 马 朋, 刘 萍, 等. 三疣梭子蟹 (Portunustrituberculatus) 4 个野生群体ITS1序列分析及系统进化分析[J]. 海洋与湖沼，2012, 43(4):769-774.

[7]金 珊, 赵青松, 王春琳, 等. 梭子蟹科六种海产蟹的RAPD标记[J]. 动物学研究, 2004, 25(2): 172-176.

[8]Liu L, Li J, Liu P, et al. A genetic linkage map of swimming crab (Portunustrituberculatus) based on SSR and AFLP markers [J]. Aquaculture, 2012b, 66-81: 344-349.

[9]韩智科, 刘 萍, 李 健, 等. 三疣梭子蟹选育家系微卫星分析[J]. 水产学报, 2012, 36(1): 25-31.

[10]Guo E, Cui Z X, Wu D H, et al. Genetic structure and diversity ofPortunustrituberculatusin Chinese population revealed by microsatellite markers[J]. Biochem Syst Ecol, 2013, 50:313-321.

[11]Jaccoud D, Peng K, Feinstein D, et al. Diversity arrays: a solid state technology for sequence independent genotyping [J]. Nucleic Acids Res, 2001, 29: e25.

[12]James K E, Schneider H, Ansell S W, et al. Diversity arrays technology (DArT) for pan-genomic evolutionary studies of non-model organisms[J]. PLoS ONE, 2008, 3(2): e1682.

[13]Wenzl P, Carling J, Kudrna D, et al. Diversity arrays technology (DArT) for whole-genome profiling of barley [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(26): 9915-9920.

[14]Xia L, Peng K, Yang S Y, et al. DArT for high-throughput genotyping of Cassava (Manihotesculenta) and its wild relatives[J]. Theor Appl Genet, 2005, 110(6): 1092-1098.

[15]Akbari M, Wenzl P, Caig V, et al. Diversity arrays technology (DArT) for high-throughput profiling of the hexaploid wheat genome[J]. Theor Appl Genet, 2006, 113(8): 1409-1420.

[16]Bolibok-Bragoszewska H, Heller-Uszyńska K, Wenzl P, et al. DArT markers for the rye genome-genetic diversity and mapping[J]. BMC Genomics, 2009, 10: 578.

[17]Hackl E, Konrad-Köszler M, Kilian A, et al. Phage-type specific markers identified by diversity arrays technology (DArT) analysis ofSalmonellaentericassp. enterica serovars Enteritidis and Typhimurium[J]. J Microbiol Meth, 2010, 80(1): 100-105.

[18]Nei M, Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76(10):5269-5273.

[19]Felsenstein J. PHYLIP-phylogeny inference package (version 3.2) [J]. Cladistics, 1989, 5:164-166.

[20]冯艳丽, 武 剑, 王晓武. 多样性序列芯片技术(DArT)的原理及应用[J]. 中国蔬菜, 2010(2): 1-6.

[21]Botstein D, White R L, Skolnick M, et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. Am J Hum Genet, 1980, 32(3): 314-331.

[22]李晓萍. 三疣梭子蟹微卫星富集文库的构建及五个野生地理群的多样性分析[D]. 青岛: 中国海洋大学，2010: 40-51.

[23]高保全, 刘 萍, 李 健, 等. 三疣梭子蟹4个野生种群形态差异分析[J]. 中国水产科学, 2007, 14(2): 223-228.

[24]冯冰冰, 李家乐, 牛东红, 等. 中国四大海域三疣梭子蟹线粒体控制区基因片段序列比较分析[J]. 上海水产大学学报, 2008, 17(2): 134-139.