胰岛素对鹅原代肝细胞增殖及蛋白合成的影响

杨文兰，韩春春，王继文，刘丹丹，万火福, 刘贺贺，潘志雄

(四川农业大学 动物遗传育种研究所，成都 611130)

胰岛素是机体内唯一促进糖原、脂肪、蛋白质合成的激素，是一种重要的体内调节因子[1]。胰岛素能够刺激许多类型的细胞和组织内蛋白质的合成[2]，同时在体外胰岛素对细胞增殖与分化具有促进作用[3]，但其对不同细胞体系的增殖作用有所不同[4]。早期的研究发现，对一些细胞体系特别是成纤维细胞, 胰岛素需在超出其生理浓度的高浓度下才有显著的促增殖作用。低浓度胰岛素(100 ng/mL)能诱导多发性骨髓瘤细胞增殖，生理浓度胰岛素(50 ng/mL)能促进肿瘤细胞增殖2～4倍[5]。有报道认为胰岛素具有促进肝再生的作用[6]，能够刺激小鼠肝细胞增殖[7]。在生产上通过对水禽进行填饲碳水化合物生产肥肝，导致肝脏和身体其它部位生长速度急剧增加，因此推测水禽具有很强的细胞增殖能力和蛋白合成功能。填饲诱导肥肝的生成伴随着血浆胰岛素浓度的升高[8]，我们推测胰岛素对肝细胞增殖和蛋白合成具有促进作用。本实验通过将不同浓度的胰岛素作用于鹅原代肝细胞，检测胰岛素对细胞增殖和蛋白合成的影响，为研究水禽肥肝生成机理奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 鹅原代肝细胞的分离与培养

采用半原位Seglen二步胶原酶灌注法分离3只天府肉鹅(Ansercygnoides)的肝细胞。全培养基包括EMDM低糖培养基和胎牛血清，将肝细胞接种到35 mm培养皿和6孔培养板中，静置在40 ℃、5% CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养。3 h后用PBS清洗3次后更换为10%血清培养基，培养24 h后换无血清培养基，再继续24 h后更换为加0 nmol/L、5 nmol/L、100 nmol/L、150 nmol/L及200 nmol/L不同浓度胰岛素处理的培养基，培养48 h后取样，每个处理重复3次。

1.2 细胞上清液谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(GPT)浓度测定

鹅肝细胞经不同浓度的胰岛素处理48 h后用2 mL EP管收集细胞培养液1 mL，用自动生化分析仪检测细胞上清液中ALT、AST浓度。

1.3 细胞上清液总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)浓度的测定

鹅肝细胞经不同浓度的胰岛素处理48 h后用2 mL EP管收集细胞培养液1 mL，用自动生化分析仪检测细胞上清液中TP、ALB浓度。

1.4 Brdu-ELISA法检测DNA含量

96孔板中鹅肝细胞加入葡萄糖处理24 h后每孔加入BrdU 10 μL标记细胞。弃液后加入固定液室温固定30 min使DNA变性，洗涤3次后加入BrdU一抗，洗涤后加入山羊抗小鼠IgG过氧化物酶共轭结合物，洗涤，添加TMB过氧化物酶作用底物，加入终止反应液终止反应，将96孔板放酶标仪上用450 nm波长检测各孔吸光度(OD值)。OD值越高表示样品中DNA含量越高。

1.5 统计学处理

采用SPSS ll.5统计软件，计量资料以均数±标准差表示，多组间指标的比较均采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，LSD—t和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胰岛素对肝细胞培养上清液中AST和ALT浓度的影响

图1表明，与对照组相比，50 nmol/L、100 nmol/L和150 nmol/L胰岛素对鹅肝细胞培养上清液中AST浓度影响不显著(P>0.05)，200 nmol/L胰岛素明显增加了鹅肝细胞培养上清液中ALT浓度，而几个浓度的胰岛素对培养上清液中AST浓度没有明显影响(P<0.05)。

2.2 胰岛素对鹅肝细胞培养上清液中TP和ALB浓度的影响

图2表明，与对照组相比，50 nml/L胰岛素对鹅肝细胞培养上清液中TP和ALB浓度没有明显影响(P>0.05)，100 nml/L、150 nml/L和200 nml/L胰岛素显著增加细胞培养上清液中TP和ALB的浓度(P<0.05)。

图1 不同浓度胰岛素对鹅肝细胞培养上清液ALT和AST浓度的影响

图2 不同浓度胰岛素对鹅肝细胞培养上清液TP和ALB浓度的影响

2.3 不同浓度胰岛素对鹅原代肝细胞DNA合成的影响

图3 不同浓度胰岛素对鹅肝细胞DNA合成的影响

Brdu-ELISA法检测DNA含量结果如图3所示，与对照组相比，随着胰岛素浓度增加鹅原代肝细胞内DNA合成的量增加。50 nmol/L、100 nmol/L和150 nmol/L 3个胰岛素处理组的鹅原代肝细胞DNA合成量差异显著(P<0.05)。

3 讨论

ALT主要存在于肝细胞浆内，只要有1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高1倍。AST主要存在于肝细胞的线粒体内，只有当肝脏发生严重坏死或破坏时，才能引起谷草转氨酶的血清浓度偏高。ALT和AST的正常参考值为0～40 U/L。本实验通过检测肝细胞培养上清液ALT和AST的浓度反映胰岛素对肝细胞损害情况的影响。实验结果显示，不同浓度胰岛素处理后的鹅原代肝细胞ALT和AST含量差异不明显(P<0.05)，且都在正常范围内，说明0～200 nmol/L胰岛素没有损害鹅肝细胞的功能。

越来越多的实验证明在体外胰岛素对细胞增殖有促进作用。胰岛素可明显促进小鼠血管平滑肌细胞[9]、心肌细胞[10]、成纤维细胞[11]、人白血病细胞[12]、肿瘤细胞[5]及骨髓瘤细胞[13]的增殖作用。Wahner Hendrickson等用不同浓度胰岛素(1.7～1722 nm/mL)作用于HL-60、U937、ML-1 细胞48 h后，结果显示1.7 nmol/L的胰岛素可促进细胞增殖，随着浓度增高，促增殖作用增强，各细胞系的最佳促进浓度不一，进一步加大浓度，促增殖作用逐渐减弱[4]。本实验BrdU-ELISA法结果表明在胰岛素浓度为0～200 nmol/L时，随胰岛素浓度的增加，细胞增殖率增加，说明0～200 nmol/L胰岛素可以促进鹅原代肝细胞增殖。

胰岛素能刺激胚胎细胞、成骨细胞和成纤维细胞及骨骼肌的蛋白合成功能[ 4,14,15]。研究表明胰岛素可以明显促进小鼠血管平滑肌细胞胶原蛋白的合成[9]，10-7nmol/L胰岛素对小鼠心肌细胞蛋白合成的促进作用最为明显[11]。另外，研究表明胰岛素通过激活mRNA翻译快速促进肌肉蛋白合成[16，17]，饲喂小鼠引起的胰岛素分泌的增加如果被药物抑制，导致蛋白翻译启动阻止和蛋白合成抑制[18]。本实验结果显示50 nmol/L胰岛素对鹅原代肝细胞培养上清液中总蛋白和白蛋白浓度没有明显影响，而100 nmol/L、150 nmol/L和200 nmol/L胰岛素显著增加鹅原代肝细胞培养上清液中总蛋白和白蛋白的浓度，表明胰岛素能够激活鹅原代肝细胞的蛋白合成功能，而具体的调控机制还有待于进一步研究。

总之，0～200 nmol/L胰岛素对鹅原代肝细胞中蛋白合成和细胞增殖具有促进作用，高浓度时促进效果更为明显。

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