陆封型和洄游型香鱼体肾组织的蛋白质组学分析
2014-03-22陆新江黄左安
陈 强，陆新江，黄左安，陈 炯
(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室, 浙江 宁波 315211)
洄游型鱼类(Amphidromous type fishes)在其生长的不同时期更换生活水域，常见的鱼类洄游包括索饵洄游、越冬洄游和生殖洄游；而陆封型鱼类(Land-locked type fishes)是由于洄游鱼类无法在繁殖季节返回到大海中，生活在湖泊中形成的。陆封型和洄游型常常同时存在于一个鱼类物种中，比较典型的有大西洋鲑(Salmosalar)[1]、胡瓜鱼(Hypomesusnipponensis)[2]以及香鱼(Plecoglossusaltivelis)[3]。有文献报道表明，洄游型和陆封型在生殖、代谢以及遗传多样性等多方面可能存在着差异，比如Drevecky等人利用微卫星位点和线粒体测序技术研究同一地区陆封型和洄游型三刺鱼(Gasterosteusaculeatus)遗传多样性的差异，提出它们之间存在生殖隔离的理论基础[4]；Morinville等人研究了陆封型和洄游型美洲红点鲑(Salvelinusfontinalis)之间食性和代谢水平的差异，指出其代谢效率和洄游行为之间存在联系[5]。鱼的体肾可以调节渗透压，维持鱼类体内的平衡和稳态，研究发现，体肾在鱼类渗透压调控，特别是鱼类在淡水和海水之间适应的过程中发挥作用[6]，因此陆封型和洄游型鱼类的体肾蛋白表达可能存在许多差异。
香鱼隶属于胡瓜目，具有散发清香、味道鲜美等优点。典型的洄游型香鱼的幼鱼在入海口孵化后回到海中过冬，到了春天，它们洄游回到溪流中生长，秋天在入海口产卵并且死去；而陆封型香鱼则生活在固定的水域，不发生洄游现象。所以，洄游型香鱼幼年期间有过海水生活的经历，而成年以后洄游型香鱼和陆封型香鱼的生存环境几乎相同。香鱼是一种研究洄游型和陆封型鱼类之间差异的良好模型，目前已知陆封型和洄游型香鱼在体型大小、幼鱼存活率等诸多方面存在差异，特别是陆封型香鱼的体型明显比洄游型香鱼小[7，8]。渗透压调控因消耗大量能量从而影响鱼类生长，体肾组织可介导渗透压调控从而影响鱼类生长[9]。我们由此假设，陆封型和洄游型香鱼体肾组织蛋白组表达差异可能解释陆封型香鱼体型偏小。
蛋白组学相关技术以其高效、功能强大等优点而在鱼类的非模式生物蛋白组相关的研究中发挥重要作用[10]。本次研究对洄游型和陆封型香鱼体肾组织蛋白组的差异进行研究，并对差异蛋白点进行鉴定。利用双向电泳和质谱技术，再参考NCBI非冗余(NCBInr)蛋白质数据库，我们鉴定了21个差异明显的蛋白点。随后利用采用荧光定量PCR(RT-PCR)技术对热适应相关蛋白65(Wap65)、热休克蛋白60(HSP60)和丙酮酸脱氢酶(E1)这3种基因mRNA含量差异进行研究，验证了双向电泳的结果。我们的实验结果为进一步从分子生化水平上分析陆封型和洄游型香鱼之间的差异奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料与试剂
健康的陆封型香鱼15条，采集自福建东张水库，洄游型香鱼13条，采集自浙江楠溪江。RNAiso试剂、Oligotex-dT30
1.2 双向电泳样品制备
购买来的陆封型和洄游型香鱼在实验条件下暂养2周，PBS清洗后快速取其体肾组织，投入液氮中保存。陆封型和洄游型香鱼分别进行3次蛋白质组学实验，每个样本来自于4条鱼的体肾组织混合样。
根据稍作改动的SWISS-2D PAGE样品准备方案，通过将陆封型和洄游型香鱼的蛋白提取物进行等量混合来制备样品。取出液氮中保存的体肾组织，进行初步分离后和含有7 M尿素、2 M硫脲、4% CHAPS(W/V)、65 mM DTT以及0.2%(W/V)两性电解质的溶液混合。蛋白质样品用丙酮进一步提取和浓缩后，达到80%(V/V)的浓度。蛋白样品的浓度通过Bradford定量法进行测定。
1.3 双向电泳及结果分析
取1 mg蛋白样品上样，使用ReadyStrip IPG胶条进行双向电泳。先采用非线性pH梯度的胶条在PROTEAN IEF Cell等电聚焦电泳仪中进行等点聚焦电泳，电泳条件为50 V进行12 h，250 V进行1 h，500 V进行1 h，1000 V进行1 h，最后用8000 V进行11 h。等电聚焦电泳结束后，将IFG胶条转移到12%的SDS-PAGE胶上，采用PROTEANII Xi垂直电泳仪进行SDS-PAGE电泳，50 mA条件下进行5 h，阳极和阴极电泳缓冲液分别为含有15%甲醇的Tris-CAPS缓冲液和含有0.1% SDS的Tris-CAPS缓冲液。SDS-PAGE电泳结束后，采用考马斯亮蓝G-250染色液进行染色。同样的方法对每个样品进行3个重复。染色结束后，采用PDQuest 2-D软件对结果进行分析。
1.4 质谱分析
根据分析结果，挑选了样品组之间有显著差异而样品重复之间无显著差异的蛋白点，将其所在位置的胶进行切割和研磨后用纯水清洗，切下来的蛋白采用含有100 mM的NH4HCO3溶液(含有10 mM的DTT)进行还原。然后采用50 mM的NH4HCO3溶液对蛋白进行清洗，干燥后用消化液进行消化，消化液为50 mM的NH4HCO3溶液 (含有12.5 ng/μL胰蛋白酶)。1 h后，上清消化液换用50 mM的NH4CO3溶液，并且37℃孵育过夜。
蛋白样品用5 μL的基质溶液溶解后进行超声2 min。取1 μL超声后的产物，用MALDI-TOF-MS/MS以及4700 Proteomics Analyzer软件进行分析。得到的数据用Mascot search V2.1软件在NCBInr蛋白质数据库中进行查找，查找设置参数为：error=100 ppm; index mode=combined (MS+MS/MS); searching database parameter=trypsin; max missed cleavage=one; variable modifications=acetyl (N-term), carbamidomethyl (C), and oxidation (M); MS/MS Fragment Toleration= 0.2 Da; precursor tolerance=0.2 Da; peptide charge=+1; maximun peptide rank=10; minimum ion score C.I.%=0。
表1 香鱼Wap65、HSP60和E1基因cDNA扩增的引物设计
1.5 mRNA表达分析
采用RNAiso试剂分别提取陆封型和洄游型香鱼肾组织的总RNA，用DNase I (RNase-free)处理后，以1 μg总RNA为模板，oligo(dT)30为引物，用AMV逆转录酶合成cDNA。设计选定基因的特异性扩增引物(表1)，采用Applied Biosystem Real-time PCR仪，以陆封型和洄游型香鱼体肾组织的cDNA为模板来分析所选基因的mRNA含量的差异，RT-PCR的方法同文献[11]。为确保准确性，每个RT-PCR反应重复3次，包括目的基因和18S rRNA。
1.6 数据分析
利用SPSS软件，采用单因素方差分析方法(one-way ANOVA)对RT-PCR的结果进行统计分析，以P<0.05作为显著差异。
2 结果与分析
2.1 双向电泳及蛋白点鉴定
A—洄游型香鱼；B—陆封型香鱼。
蛋白点a含量差异bP值蛋白名称登录号c理论pI/分子量物种覆盖率蛋白得分总/最佳离子得分15.2350.003NADH脱氢酶gi|515920635.64/28.7非洲爪蟾(Xenopus tropicalis)31332273/78212.8660.006异柠檬酸脱氢酶gi|410546518.35/50.4斑马鱼(Danio rerio)43467317/105328.7110.022NADH脱氢酶gi|512306258.72/53.7斑马鱼38458349/13650.0910.000β-肌动蛋白gi|34522795.46/13.4比目鱼(Pseudopleuronectes americanus)70487431/10363.7690.001α-微管蛋白gi|359029194.97/49.9斑马鱼61946768/119713.6460.000热适应相关蛋白65gi|143885835.58/50.0鲤鱼(Cyprinus carpio)169580/6483.5680.001热休克蛋白60gi|310444895.56/61.2斑马鱼47716628/159110.2820.001铁蛋白gi|45858165.84/13.6青鳉(Oryzias latipes)23347313/138127.3540.000丙酮酸脱氢酶gi|472103416.2/39.3斑马鱼39232191/68130.0480.000β-肌动蛋白gi|98647805.15/32.0旱獭(Marmota monax)62481364/109140.1020.000氨基酰化酶gi|2135154845.28/47.0大西洋鲑鱼(Salmo salar)9168159/88160.4320.005甲硫氨酸腺苷转移酶gi|453616396.02/43.7非洲爪蟾22284256/145172.9510.006异柠檬酸脱氢酶gi|281788328.88/50.9人(Homo sapiens)33181154/59180.290.002过氧化物酶gi|505399965.93/21.8斑马鱼29317243/77190.1210.000丙氨酸乙醛酸转移酶gi|470859358.98/46.2斑马鱼2711488/88207.3440.000碳酸酐酶gi|188583797.12/28.7斑马鱼14145138/74210.0320.001丙氨酸乙醛酸转移酶gi|470859358.98/46.2斑马鱼58205187/83220.1040.004磷酸烯醇丙酮酸羧激酶gi|470859838.72/69.7斑马鱼1710993/59238.4330.003烯醇酶gi|475513176.25/47.4斑马鱼46728532/138243.2940.001异柠檬酸脱氢酶gi|410546518.35/50.4斑马鱼39172106/402577.4780.000乳酸脱氢酶gi|562662567.75/36.4薄鳞突吻鳕(Coryphaenoides armatus)30383335/85
a编号对应于图1，差异表达蛋白认定为有2倍以上光密度差异，且P< 0.05；b陆封型和洄游型样品中对应蛋白点含量的比，以洄游型为分母；c来源于NCBInr蛋白质数据库。
双向电泳后采用考马斯亮蓝G-250染色并用PDQuest 2-D软件进行分析后，发现体肾组织总可溶性蛋白的双向电泳图谱共有25个蛋白点具有显著性表达差异(t-test,P<0.05)(图1)，Mascot检索成功鉴定出21个蛋白点(表2)。和洄游型香鱼相比，陆封型香鱼体肾组织表达上升的蛋白包括：NADH脱氢酶(点1，3)、异柠檬酸脱氢酶(点2，17，24)、α-微管蛋白(点6)、Wap65(点7)、HSP60(点8)、E1(点12)、碳酸酐酶(点20)、烯醇酶(点23)和乳酸脱氢酶(点25)；陆封型香鱼体肾组织表达下调的蛋白包括：β-肌动蛋白(点5，13)、铁蛋白(点11)、氨基酰化酶(点14)、甲硫氨酸腺苷转移酶(点16)、和过氧化物酶(点18)、丙氨酸乙醛酸转移酶(点19，21)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(点22)。结果揭示，这些蛋白分别为能量代谢、应激反应、氨基酸代谢和细胞骨架等相关蛋白。
2.2 陆封型香鱼体肾组织含量高的蛋白
在鉴定出来的陆封型香鱼体肾组织中含量较高的蛋白中，NADH脱氢酶(点1)位于线粒体内膜，是一种催化电子从NADH传递给辅酶Q的酶。异柠檬酸脱氢酶(点2，17，24)是一种与能量代谢有关的酶，在三羧酸循环中可以将异柠檬酸转化为α-酮戊二酸。α-微管蛋白(点6)是构成微管蛋白的一个亚基，参与到微管蛋白的作用中。Wap65(点7)是一种与生物体温度适应相关的蛋白质，且分子量为65 kDa[12]。HSP60(点8) 是HSP蛋白家族的一种，因其在温度升高时表达量增加且分子量为60 kDa而得名[13]。E1(点12)在生物体内催化丙酮酸转变成乙酸辅酶A，此反应是连结糖酵解与柠檬酸循环的反应。碳酸酐酶(点20)是一种重要的锌酶，可以催化二氧化碳和水快速生成碳酸根离子和氢离子的反应及其逆反应，维持血液和其它组织的酸碱平衡。烯醇酶(点23)催化从2-磷酸甘油酸形成高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸，是糖酵解中的关键酶之一。乳酸脱氢酶(点25)能催化乳酸脱氢生成丙酮酸，是参与糖无氧酵解和糖异生的酶。
2.3 陆封型香鱼体肾组织含量低的蛋白
在鉴定出来的陆封型香鱼体肾组织中含量较低的蛋白中，β-肌动蛋白(点5，13)是6种肌动蛋白异构体中的一种，而肌动蛋白在肌肉的收缩、细胞的转移与分裂、细胞信号转导及细胞形状的建立和维持等方面具有重要作用。铁蛋白(点11)是一种可以贮存和释放铁离子的细胞内蛋白质，其含量反映了细胞内铁离子的贮存量。氨基酰化酶(点14)是一种催化N-酰基-L-氨基酸和水反应生成L-氨基酸的酶，这种酶参与尿素循环和氨基酸代谢。甲硫氨酸腺苷转移酶(点16)是一种催化ATP和甲硫氨酸合成S-腺苷甲硫氨酸的酶。过氧化物酶(点18)是一类还原过氧化物的酶类，有抗氧化作用。丙氨酸乙醛酸转移酶(点19，21)是一种催化丙氨酸和乙醛酸反应生成丙酮酸和甘氨酸的酶，属于氨基转移酶的一种。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(点22)是糖异生作用中的限速酶，可以催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和二氧化碳。
2.4 陆封型和洄游型香鱼体肾组织Wap65、HSP60和E1基因mRNA含量差异
由于Wap65、HSP60和E1基因3种蛋白在蛋白质组学结果中表达上调，而且Wap65和HSP60与鱼类的环境应激相关而影响鱼类生长[14]，E1与能量代谢相关将直接影响鱼类生长，我们也假设这3个蛋白表达变化可能与陆封型和洄游型香鱼的体型变化存在紧密联系。因此我们采用RT-PCR研究陆封型和洄游型香鱼中体肾组织中Wap65、HSP60和E1基因的mRNA表达差异，来验证蛋白质组学的结果。结果表明，和洄游型香鱼相比，陆封型香鱼的体肾组织中Wap65(11.905倍)、HSP60(3.759倍)和E1(5.236倍)基因的mRNA表达量显著升高，这与双向电泳的分析结果一致(图2)。
图2 陆封型和洄游型香鱼体肾组织中Wap65、HSP60和E1基因mRNA的含量差异
*—显著性差异(n=4,P<0.05)
3 讨论
在此研究中，我们应用双向电泳和质谱技术，来研究洄游型和陆封型香鱼体肾组织中蛋白组的差异。研究结果发现陆封型和洄游型香鱼之间存在含量显著差异的蛋白，而且这些蛋白主要参与能量代谢、应激反应、氨基酸代谢以及构成细胞骨架等过程。
我们的研究结果发现，一些应激反应相关蛋白在陆封型香鱼中表达量较高。研究表明，Wap65在鱼类的病原菌感染中发挥保护作用[12]。而且香鱼受到鳗弧菌感染后，Wap65表达量显著增加，表明Wap65可以作为香鱼的一种急性期反应蛋白(Acute phase reaction protein)，参与其应激免疫反应[11]。HSP60是热休克蛋白(Heat shock protein)的一种，可以参与维持细胞代谢的稳态[13]。近来的研究表明，HSP60通过参与应激免疫反应，在鱼类的特异性和非特异性免疫反应中发挥作用。在鱼类的生活环境中，温度变化、渗透压变化及食物等因素可以引起鱼类的应激[15]。在我们的研究结果中，陆封型香鱼体肾组织中的Wap65和HSP60含量显著高于洄游型香鱼，可能表明陆封型香鱼对环境应激比洄游型香鱼更为敏感。由于洄游型香鱼生活经历比陆封型香鱼丰富，而成年以后其生活环境与陆封型香鱼接近，有论文在动物中的研究发现生命早期的有益经历会改进动物成年以后对应激的反应[16]，这可能是洄游型香鱼相对于陆封型香鱼应激蛋白含量低的原因。铁蛋白和过氧化物酶与机体的抗氧化反应相关[17]。我们的实验结果中，相比于洄游型香鱼，陆封型香鱼体肾组织中铁蛋白和过氧化物酶含量较低，因此可以推测铁蛋白和过氧化物酶可能也参与了香鱼对环境应激的反应，这两个蛋白在陆封型香鱼表达含量低，可能会造成陆封型香鱼对环境应激反应更强。
鱼类的能量代谢和其是否洄游之间存在密切联系，洄游过程对其能量代谢存在影响[18]，有研究表明，与非洄游时期相比，一些鱼类在进行洄游过程中，能量代谢方式发生变化[19]。在我们的结果中，陆封型香鱼体肾组织中的异柠檬酸脱氢酶、NADH脱氢酶、E1、烯醇酶和乳酸脱氢酶表达量较高，这些酶都是糖酵解和三羧酸循环中的关键酶，可能表明陆封型和洄游型香鱼的糖代谢能力发生了改变。
我们的结果还发现丙氨酸乙醛酸转移酶和甲硫氨酸腺苷转移酶在陆封型香鱼含量较低。丙氨酸乙醛酸转移酶和甲硫氨酸腺苷转移酶都是参与氨基酸代谢的酶类。丙氨酸乙醛酸转移酶利用丙氨酸和乙醛酸生成甘氨酸和丙酮酸，而生成的甘氨酸，又可以在色氨酸羟甲基转移酶的作用下，生成色氨酸，进而参与一系列的氨基酸代谢过程。甲硫氨酸腺苷转移酶催化ATP和甲硫氨酸合成S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)，而这个过程也是甲硫氨酸循环的限速步骤[20]。这个结果说明，相对于洄游型香鱼，陆封型香鱼的氨基酸代谢能力可能较弱。这可能与洄游型香鱼早期生活在近海，食物中蛋白较为丰富有关。
综上所述，在陆封型和洄游型香鱼的体肾组织中，与能量代谢、应激反应等相关的蛋白质的含量具有显著的差异，可能提示陆封型和洄游型香鱼在环境应激和能量代谢等层面有明显的差异。我们的研究结果不仅为进一步研究陆封型和洄游型香鱼的差异提供了基础，对陆封型香鱼的种群保护和良种培育也具有一定的理论指导意义。
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