黄连木叶粗多酚的纯化及其抗氧化研究

邓冠军 , 汤明礼 , 张 旋, 黄胜威, 吴丽芳

(1. 安徽大学 生命科学学院, 合肥 230039； 2. 中国科学院 合肥物质科学研究院离子束生物工程学重点实验室 国家林业局能源林研究中心, 合肥 230031)

黄连木(PistaciachinensisBunge)属于漆树科黄连木属落叶乔木，在中国广泛分布。其种子平均含油率约35.05%，出油率为20%～30%[1]，具有开发优质食用油的潜质[2]。黄连木树皮、树叶均可入药[3]，果实、果柄和叶富含挥发油，对植物病原真菌具有一定的抑制作用[4]。此外，黄连木树各部分都有特殊气味，熬制的水溶液是较好的农药，可杀各种水稻害虫和蚜虫。研究显示，黄连木的不同部位都富含多酚类物质[5]。因此针对黄连木叶进行多酚提取分离研究，并挖掘其生物活性，为进一步提高对黄连木的综合利用提供理论和技术支撑。

氧化应激被认为是很多疾病的病理发生的一个重要因素，比如肿瘤、阿尔茨海默氏症和帕金森氏症的疾病等,当体内产生过多的ROS对蛋白质、脂肪、DNA和其它生物分子都有很大的破坏，导致细胞丧失整体性和一些功能。植物提取物具有广泛地生物活性，其中抗氧化活性与延迟衰老和抗肿瘤等密切相关。本文采用经济、简便、快速可靠的方法(DPPH和FRAP法)对纯化后产物的抗氧化活性进行快速评价。

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)与人类基因有60%～80%同源[6]，很多生物学基础和哺乳类动物也高度一致，而且生活史短。因而，秀丽隐杆线虫经常被用作抗氧化、衰老和环境毒理等研究及药物靶位点的筛选[7-9]。本文以线虫为活体模型，对黄连木叶纯化多酚的体内抗氧活性进一步进行评价，为黄连木叶多酚应用和开发提供理论基础，同时也为提高能源林的经济效益进行有益探索。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

黄连木叶片2012年8月份采集于合肥市郊区，采集后杀青处理并60℃烘干，粉碎过筛(直径为0.25 mm)。-20℃保存。

提取试剂均为国产分析纯试剂。200～300目硅胶购自国药集团。2，7二氯荧光素二乙酸(2，7-Dichlorofluorescein diacetate)，胡桃醌(Juglone)，1，1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH)。

1.2 仪器与设备

Allegra X-22R 离心机(Sigma)，UV-2550型紫外线可见光光度计(SHIMADZU)，RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SZM45-B2体视显微镜(宁波舜宇仪器有限公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 供试样品的制备黄连木叶粗多酚提取参考张旋等方法[10]。粗多酚的纯化参考Tang 等[11]的方法：称40 g硅胶粒(200～300目)，在105℃干燥30 min。将硅胶粒转移到100 mL 洗脱液(氯仿∶甲醇=4∶6)浸泡30 min，湿装柱法装柱(2.5 cm/73 cm)。 将0.40 g粗多酚溶于5 mL 洗脱液(氯仿∶甲醇=4∶6)，混匀后上样，用200 mL 洗脱液(氯仿∶甲醇=4∶6)进行洗脱，流速为1秒2滴，收集洗脱液1.50 mL每管，共150 mL。将收集洗脱液用福林酚法(Folin-Ciocalteau法)检测样品中的多酚，发现多酚主要集中从30 mL到120 mL洗脱液中，共收集90 mL，再用旋转蒸发仪将其蒸干成粉末即得到黄连木叶纯化多酚。

1.3.2 多酚含量测定采用福林酚法 (Folin-Ciocalteau法)[12]。单宁含量的测定参照李静等[13]的方法。黄酮含量的测定参照裴咏萍等[14]的方法。DPPH法测定黄连木叶多酚清除自由基能力参考王晶等[15]的方法。 FRAP法测定黄连木叶多酚抗氧化活性参考Benzie等[16]的方法。

1.3.3 黄连木叶多酚提高线虫存活率 参考Hsu等[17]的方法。将同步化L1期N2线虫培育于S-液体培养基，加入0.50 mL 大肠杆菌菌株(Escherichiacoli) OP50。然后分别加入不同浓度纯化多酚(0，100，200 μg/mL)。20℃培育72 h，3300 r/min离心2 min。将线虫转移到250 μmol/L胡桃醌(Juglone)溶液中，20℃处理200 min，24 h后计数线虫的存活率。重复3次。

1.3.4 黄连木叶多酚对线虫体内ROS的抑制效应

参考Hsu等[17]的方法。线虫培养和样品处理同1.3.3。将线虫转移到150 μmol/L 胡桃醌溶液中20℃处理1 h，M9离心洗涤2次。将线虫转移到10 μmol/L的2，7二氯荧光素二乙酸溶液，20℃处理30 min。随机挑出线虫放在载玻片上，5 mM盐酸左旋咪唑(Levamisole) 麻醉，荧光体视显微镜观察拍照(曝光时间4 s)。Image-Pro Plus 6.0统计分析线虫荧光强度。

1.4 数据处理

Image-Pro Plus 6.0统计分析荧光强度，ANOVA法(SPASS 16.0)显著性检验。选取P< 0.05为显著水平，线性回归方程计算IC50(为清除率达到50%时的样品浓度)。样品纯化率=(A1-A0)/A0*100%。(A0为黄连木叶粗多酚成分的测定参数，A1为黄连木叶多酚成分的测定参数)

2 结果与分析

2.1 黄连木叶粗多酚纯化

本文采用二元洗脱法，并根据薄层层析预实验结果筛选系统液以达到较好的多酚富集。黄连木叶粗多酚样品0.4000 g经过硅胶柱得到0.2330 g纯化产物，纯化得率为58.25%。

2.2 纯化产物的多酚含量

采用Folin-Ciocalteau比色法测定黄连木叶多酚的多酚含量，以没食子酸为对照品，其结果见表1。纯化前后的总酚含量分别为0.8400 g和1.0125 g当量没食子酸每克样品，纯化后多酚含量提高了20.54%。根据硅胶粒对不同极性物质具有不同吸附力能力，收集多酚含量高洗脱部分，从而使多酚类物质富集，与色素类等物质分离[18]。因此，经过硅胶柱纯化后酚类物质的含量得到提高。

2.3 纯化产物的单宁含量

采用福林酚-丹尼斯法(Folin-Denis法)测定单宁含量，以单宁酸为对照品，其结果见表1。黄连木叶多酚纯化前后的单宁含量分别为0.7575 g和0.8600 g当量单宁酸每克样品，单宁含量提高了13.53%。通过硅胶柱纯化后，黄连木叶提取物中酚类物质的含量提高，而单宁与多酚类物质的极性很接近，即和硅胶粒的吸附能力也差不多，因而在纯化多酚类物质同时也在富集单宁。

表1 黄连木叶提取物纯化前后总酚、单宁和总黄酮的含量

2.4 纯化产物的黄酮含量

采用三氯化铝法测定黄连木叶多酚中黄酮含量，以芦丁为对照品，结果见表1。黄连木叶多酚纯化前后的黄酮含量分别为0.1297 g和0.1453 g当量芦丁每克样品，黄酮提高12.03%。本文主要目的旨在提高提取物的多酚含量，未对不同性质的多酚成分进行分级分离。黄酮作为多酚的一部分，通过硅胶柱纯化后，其含量自然也随着黄连木叶纯化产物中多酚类物质的含量增加而提高[19]。

图1 维生素C、茶多酚、黄连木叶粗多酚和黄连木叶多酚对DPPH·清除作用

2.5 纯化产物清除DPPH自由基的能力

黄连木叶多酚纯化产物对DPPH的清除能力见图1。实验结果表明，纯化产物清除DPPH自由基能力强于黄连木叶粗多酚，也强于维生素C(Vitamin C)，但微弱于98%茶多酚。DPPH自由基清除率与酚类物质含量呈正相关，说明酚类物质在DPPH自由基清除过程中起到主要作用。黄连木多酚的清除能力没有茶多酚强，可能由于纯化后黄连木多酚的纯度仍然没有达到商品化茶多酚的纯度。另外，DPPH自由基的清除率还与其中所含有酚类化合物的种类和极性有关，中等极性的酚类物质对DPPH自由基清除率较高。两种提取物的清除能力差异也可能是所含酚类的极性不一样导致的[20]。IC50(当50%DPPH自由基被清除时的试样浓度)的结果见表2。茶多酚、维生素C、黄连木叶粗多酚和黄连木叶多酚纯化产物的IC50分别为2.75 mg/L、4.03 mg/L、3.57 mg/L和3.02 mg/L，结果表明黄连木叶多酚具有比较强的抗氧化能力。

表2 维生素 C、茶多酚、黄连木叶粗多酚和黄连木叶多酚IC50和 FRAP10

2.6 FRAP法测定黄连木叶多酚纯化产物抗氧能力

图2 FRAP法测定维生素C、茶多酚、黄连木叶粗多酚和黄连木叶多酚的FRAP值Fig 2 FRAP values of vitamin C, tea polyphenols，crude polyphenols and polyphenols of P. chinensis leaf

由图2可知，用FRAP法测定的黄连木叶多酚抗氧活性具有明显的剂量效应，纯化多酚强于粗多酚和维生素C，但稍弱于纯茶多酚。FRAP10(表10 μg/mL样品浓度下FeSO4当量)结果见表2。抗氧化能力排序结果为茶多酚0.22、黄连木叶多酚0.20、黄连木叶粗多酚0.17及维生素C 0.16 (mmolFeSO4/L当量)。FRAP法和DPPH法测定黄连木叶多酚抗氧活性弱于茶多酚，而强于黄连木叶粗多酚和维生素C结论是一致的，但是这两种方法测得这4种物质的抗氧活性在强弱的顺序上存在差异，可能与DPPH和Fe3+提供电子能力不同和这两个物质还原能力不一样以及实验参数衡量的参考水准不一样有关。

2.7 黄连木叶多酚纯化产物对线虫存活率的影响

黄连木叶多酚对胡桃醌处理后秀丽隐杆线虫的存活率的影响见图3。胡桃醌(Juglone) 能显著升高线虫体内ROS[17]，并导致线虫死亡。但是经过黄连木叶多酚预处理后，线虫的存活率显著提高，说明黄连木叶多酚具有比较强的抗氧能力。ROS通常被认为是机体氧化反应中产生的有害化合物，具有强氧化性。过量的·0和·OH氧化细胞膜中不饱和脂肪酸引起脂质过氧化、交联、聚合成脂褐素(一种难以消除的惰性废物)，导致脂褐素堆积在细胞内毒害细胞。同时也对核酸进行氧化和交联，使发生断裂、突变，从而严重影响蛋白质遗传信息的正常转录和翻译，阻止细胞内物质和信息的传递，进而引起细胞调亡和机体衰老死亡效应[21]。而黄连木叶多酚能有效降低ROS损伤导致的线虫死亡率。

图3 黄连木叶多酚对线虫存活率的影响

2.8 黄连木叶多酚纯化产物影响线虫体内ROS水平

为了进一步验证黄连木多酚对线虫的保护作用与清除ROS直接相关。本文对黄连木叶多酚抑制线虫细胞内的ROS进行检测，结果见图4。线虫经过胡桃醌(Juglone)处理后产生高浓度ROS[22]，而不同浓度的黄连木多酚可以有效的抑制其体内的ROS。因此，黄连木叶多酚具备开发成为新的天然抗氧化剂，并应用于食品、保健和医药产品领域。

a—阳性对照； b—50 μg/mL多酚预处理； c—100 μg/mL多酚预处理； d—200 μg/mL多酚预处理； e—抑制ROS统计结果。

图4黄连木叶多酚对线虫体内ROS的抑制效应

Fig 4 The ROS inhibitory effect of polyphenols fromP.chinensisleaf

3 结论

黄连木叶粗多酚经过硅胶柱纯化后，其多酚、单宁、黄酮含量分别为1.0125 g当量没食子酸每克样品、0.8600 g当量单宁酸每克样品和0.1453 g当量芦丁每克样品。与粗多酚相比多酚含量提高了20.54%，单宁含量提高了13.53%，黄酮含量提高了12.03%。因而硅胶柱色谱法对酚类是个很好的纯化方法，而且通过体内和体外抗氧化法测定表明随着酚类含量的提高，抗氧化活性也显著性提高。因而黄连木叶多酚具有抗氧化性，是很好的天然抗氧化剂，具有在食品、保健等多个领域应用的前景。

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