葡萄糖氧化酶解除黄曲霉毒素B1应用研究

胡常英，王云鹏，范 星，秦慧娟

(1. 河北省微生物研究所，保定 071051； 2. 河北师范大学生命科学学院，石家庄 050024； 3. 石家庄理工职业学院，石家庄 050228)

黄曲霉毒素是一类由真菌产生的能引起人和动物疾病的剧毒物质。它普遍存在于粮食、油料作物的种子、水果、蔬菜中，甚至在乳制品、肉类、海鲜类的加工产品中也发现了黄曲霉毒素。黄曲霉毒素对人和动物都表现了很强的急性毒症反应，具体表现为发烧、呕吐、腹泻、厌食、肠胃功能紊乱等现象[1，2]。自20世纪60年代发现黄曲霉毒素中毒症以来，相继又发现了100多种真菌毒素，经试验证明，尤以黄曲霉毒素B1毒性最强。据资料调查显示，世界上每年有数千万只家畜、家禽因黄曲霉毒素中毒死亡。这已引起世界各国的高度重视。

黄曲霉毒素的解毒方法很多，可分为物理、化学和微生物法等几种[3]。物理法主要采用活性炭及矿物质等吸附材料吸附毒素，此法会受到材料吸附能力的限制；化学法以有机溶剂沉淀为主，在去除毒素的同时，其粮食或饲料的营养成分有所损失；微生物降解法是目前解毒研究推广的重点方法之一[4-6]。微生物降解法的精华是微生物代谢产物——微生物酶[7]。酶可破坏黄曲霉毒素的分子结构，使之失去毒性作用。因此，微生物酶被公认为是理想的解毒剂之一。葡萄糖氧化酶是一种饲料添加剂，它是一种需氧脱氢酶[8]，具有调节动物胃肠中菌群平衡的功效。经大量的应用试验证实，该酶具有抑制黄曲霉菌生长和降解黄曲霉毒素的作用。尤其用于小鸡饲料防霉和解毒剂，效果更佳。

1 实验材料与方法

1.1 材料

实验选用“京粉”品种的1日龄小鸡2000只为试验对象，分别以固体和液体两种葡萄糖氧化酶(河北省微生物研究所产)为解毒酶制剂，固体酶中葡萄糖氧化酶含量25 U/g和液体酶中为25 U/mL，以含500 ppb和2000 ppb黄曲霉毒素B1(Sigma公司产)的玉米饲料为有毒源进行分组实验。

实验地点：河北保定。

1.2 试验方法

将2000只小鸡分为两大组，分别为固体酶试验和液体酶试验。每大组1000只小鸡均分为5组，每组200只。分别为自然对照组(饲料中不含黄曲霉毒素B1，也不含葡萄糖氧化酶)；500 ppb对照组，饲料中含500 ppb浓度的黄曲霉毒素B1，不加葡萄糖氧化酶；500 ppb加酶组，饲料中含500 ppb浓度黄曲霉毒素B1，同时按5‰比例加入葡萄糖氧化酶饲料添加剂； 2000 ppb对照组，饲料中含2000 ppb浓度黄曲霉毒素B1；2000 ppb加酶组，饲料中含2000 ppb黄曲霉毒素B1和5‰葡萄糖氧化酶饲料添加剂。

固体酶采用与饲料混合方式喂养；液体酶饲料添加剂按5‰(体积比)加入饮用水中，采用饮水方式喂养。

实验采用间歇喂养方式进行，每个阶段连续喂养15 d和停止7 d为一个周期。每天观察小鸡体貌特征，活动现象，啄食兴趣情况等，并连续记录35周中小鸡死亡数量。

2 试验结果与讨论

2.1 表观现象

小鸡出生后对饲料和饲料添加剂不适应，摄食量甚少,一周后增加食欲。从第二周开始，摄食含黄曲霉毒素B1500 ppb和2000 ppb饲料的对照组均有明显腹泻现象，而且，毒素浓度大，腹泻严重。部分小鸡活动迟缓，病态。添加葡萄糖氧化酶组腹泻较轻。精神状况好于对照组。从表观现象看，在35周的试验过程中，加葡萄糖氧化酶饲料喂养的小鸡比不加酶含有毒素的对照组有精神，有活力，啄食欲望强，鸡毛顺流、光滑、整齐。整体分析，500 ppb加酶组精神状况要好于自然对照组；2000 ppb加酶组与自然对照组相比较差。

从以上表观现象分析，葡萄糖氧化酶对解除黄曲霉毒素B1表现了较好的作用，尤其在500 ppb低浓度下，完全可以解除黄曲霉毒素B1的危害，使机体的抗病能力好于自然对照组。添加固体酶解毒现象好于液体酶。

2.2 黄曲霉毒素B1中毒小鸡死亡数量比较

2.2.1 固体酶解毒效果

在饲料中含黄曲霉毒素B1500 ppb和2000 ppb浓度喂养试验中，高浓度和低浓度及加酶组和对照组中小鸡的死亡数量均有明显差异，固体酶与液体酶解毒效果也有差距。应用固体酶解毒试验，具体记录数据见表1，第35周小鸡存活率结果见表2。

表1 35周内固体酶解毒小鸡死亡数量统计Table 1 The death quantity of the chicken after treated with glucose oxidase in 35 weeks

表2 第35周固体酶解毒小鸡存活率比较Table 2 The suvival ratio of the chicken after treated with solid glucose oxidase in the 35th week

自然对照组中，在35周试验中共死亡30只，存活率达85%。15周左右处于死亡高峰。小鸡孵出10周内，机体免疫力主要来源于母体遗传因素，在10周前后处于转折阶段，由母体携带到自身产生变化，此阶段机体抗病能力低，传染性病毒疾病易发作[9，10]，死亡率较高。

500 ppb对照组存活率为65.5%，与自然对照组相比，存活率下降19.5%。加喂葡萄糖氧化酶后，与对照组相比，存活率提高了21%，比自然对照组存活率高1.5%。通过以上几组数据比较显示，葡萄糖氧化酶对黄曲霉毒素B1有较好的解毒作用。饲料中含黄曲霉毒素B1在500 ppb浓度下，完全可以解除毒性作用。

2000 ppb浓度喂养小鸡，由于黄曲霉毒素B1浓度大，毒力强，死亡高峰在第11周出现，比500 ppb组提前5周。加酶组与对照组相比，存活率提高39.5%。虽然151只低于500 ppb组的173只的存活数量，但足以显示葡萄糖氧化酶较强的解毒能力。

由葡萄糖氧化酶酶促反应原理分析得出，葡萄糖氧化酶进入胃肠后，大大降低氧含量，抑制好氧菌生长，促进厌氧菌生长繁殖，有利于饲料分解、吸收，加强了机体代谢作用，提高了小鸡解毒和抗病能力。

2.2.2 液体酶解毒效果

液体酶不便于加入饲料中，而是采用饮水方式喂养。液体酶喂养解毒效果见表3,存活率比较见表4。

表3 35周内液体酶解毒小鸡死亡数量统计Table 3 The death quantity of the chicken after fed with liquid glucose oxidase in 35 weeks

表4 第35周液体酶解毒小鸡存活率比较Table 4 The suvival ratio of the chicken after treated with liquid glucose oxidase in the 35th week

注:试验小鸡未注射动物疫苗。

液体酶解毒试验中，各组现象与固体酶解毒基本相同，两个浓度对照组数据与固体酶实验中基本一致，但加酶组小鸡存活数量均偏低。500 ppb浓度加酶组比对照组存活率提高19%，但与固体酶组相比下降2%；2000 ppb加酶组比对照组提高28.5%，与固体酶组相比下降11%。酶活力单位含量相同，只是喂养方式不同。由于小鸡个体饮水情况不同，饮用量也不同，解毒效果不整齐，整体葡萄糖氧化酶摄入量少于饲料喂养方式，解毒效果整体下降。因此，液体酶可采用低浓度长期饮水喂养，以提高机体免疫力，提高解毒和抗病能力。

据有关资料报道，小鸡饲用含黄曲霉毒素B1的饲料后死亡的原因，主要是毒素大量聚集肝脏中，出现肝脏肿大、病变[11, 12]。病变的肝脏严重影响毒素的代谢和排除功能，形成恶性循环，直至小鸡死亡。与饲料一起进入胃肠中的葡萄糖氧化酶因环境条件合适，即可发挥作用，因此，胃肠道也是解毒场所，部分毒素在胃肠中被解毒，肝脏中聚集的毒素大大减少。部分葡萄糖氧化酶进入肝脏，加速肝脏的氧化还原反应，机体解毒过程即氧化还原反应过程，加速毒素的代谢，维护了肝脏健康。

葡萄糖氧化酶解毒机理推测：葡萄糖氧化酶的辅基对黄曲霉毒素B1的功能原子组中呋喃环具有强力破坏作用，使呋喃环打开形成酸端，黄曲霉毒素B1分子结构发生改变，从而失去毒性作用。

葡萄糖氧化酶在动物胃肠道内还可发挥酸化剂作用，降低pH值，有利于自身各种酶保持和发挥活性作用，以加强和促进动物体内的生理代谢，加强机体解毒和排毒功能。

3 实验结论

葡萄糖氧化酶用于解除小鸡饲料中黄曲霉毒素B1毒性试验，固体酶喂养中，在500 ppb黄曲霉毒素B1浓度下，35周内存活率比对照组提高21%，与自然对照组相比提高1.5%，在此浓度下，黄曲霉毒素B1毒性完全解除，小鸡的生命体征恢复到正常水平；2000 ppb浓度下，存活率比对照组提高39.5%，解毒效果显著，但存活率仅相当于自然对照组的88.82%。

在饮用水中添加液体葡萄糖氧化酶解毒效果次于固体酶。500 ppb黄曲霉毒素B1浓度下与对照组相比，存活率提高19%；2000 ppb浓度下，存活率比对照组提高28.5%。与固体酶相比，500 ppb浓度时小鸡存活率低2%；2000 ppb浓度下存活率低11%。

总之，在饲料或饮用水中加入5‰ 25U/g(mL)葡萄糖氧化酶,用于小鸡35周内解除500 ppb、2000 ppb浓度黄曲霉毒素B1效果显著，没有表现其它不良现象。

参考文献：

[1]居乃琥编.黄曲霉毒素[M].北京：轻工业出版社，1版，1980，161-210.

[2]李金玲主编.禽病防治技术[M].北京：中国轻工业出版社，1版，2012,246-247.

[3]陈龙宾, 刘景喜主编.常见畜禽霉菌毒素中毒与防治[M].天津：天津科技翻译出版社，1版，2012,60-76.

[4]马志科,昝林森.黄曲霉毒素的危害检测及生物降解研究进展[J].动物医学进展，2009,30(9): 91-94

[5]刘 畅，刘 阳，刑福国.黄曲霉毒素生物学脱毒方法研究进展[J].食品科技,2010,35(5): 290-293.

[6]刘大岭，姚冬生，陈敏峰.真菌提取液对黄曲霉毒素解毒作用的研究[J].广东药学院学报，1995，11(2): 92-94.

[7]刘大岭.黄曲霉毒素生物酶解毒研究——黄曲霉毒素B酶解毒机制研究[D].广州：中山大学，1998.

[8]胡常英，刘丽娜，王云鹏，等.点青霉HW2203葡萄糖氧化酶应用特性研究[J].生物学杂志，2008,25(1)：31-34.

[9]刘兴友主编.家禽免疫抑制病[M].北京：中国农业出版社,1版，2011，71-73.

[10]刘安典主编.家用畜禽疫苗及生物制品使用手册[M].北京：中国农业出版社，1版，2008，2-36.

[11]武 瑞 孙东波主编.禽病防治技术[M].北京：中国农业出版社,1版，2012，319-321.

[12]张志新 杨洪民主编.现代养鸡疫病防治手册[M].北京：科学技术出版社，1版，2011，267-269.