植物免疫应答过程中Ca2+及CaM/CML的功能

张 超，赵 芊，张 哲，宋水山

(1. 河北工业大学 化工学院，天津 300130； 2. 河北省科学院 生物研究所，石家庄 050081；3. 河北省主要农作物病害微生物控制工程技术研究中心，石家庄 050081)

植物拥有一套免疫系统以应对病原物的侵染。植物主要通过两种方式进行自身防卫以对抗病原体侵袭。第一种方式，即病原相关分子模式(PAMPs)触发的免疫反应(PTI)[1]，如细菌鞭毛蛋白flg22和延伸因子Tu elf18，这些PAMPs分别由不同的受体激酶特异性识别，激活多种信号传递事件，启动广泛非特异性免疫反应。为了抵御这种基础防御，病原体产生一系列的效应子(effectors)进入植物细胞从而触发植物第二种防御方式，即病原效应物触发的免疫效应(ETI)，起始于相应的植物抗性蛋白特异性识别病原体效应子，诱导过敏反应(HR)，使感染部位周围的植物细胞凋亡，从而阻止病原体在植物细胞中的进一步扩散[2]。在这些防卫反应中，Ca2+-CaM信号系统发挥着至关重要的作用。

Ca2+是一种普遍存在的第二信使，多种信号刺激如光、温度、干旱、盐、病原体等均可引起植物细胞Ca2+浓度上升，不同的刺激赋予Ca2+信号不同的特征，从而引起植物细胞产生对应的生理反应[3]。Ca2+信号的这种刺激特异性源于细胞质膜及内膜系统上离子通道及泵对Ca2+流的严格控制[4]。特定的Ca2+信号由Ca2+结合蛋白至下游效应子引起的细胞反应。

Ca2+结合蛋白主要包括3个亚家族：钙调素(CaM)和钙调素类蛋白(CMLs)、Ca2+依赖蛋白激酶(CPKs)、钙调素B类蛋白(CBLs)及其相互作用蛋白[5]。CaM广泛存在于所有真核生物中，在进化上高度保守，而CMLs、CPKs以及CBLs仅存在于植物和原生生物中[6]。Ca2+作为一种多功能第二信使参与植物的多种生长发育和胁迫反应过程，有关Ca2+信号系统已经在植物生物学的许多领域得到详细研究。本文主要就植物—病原体相互作用中Ca2+-CaM信号系统在调节植物免疫过程中的作用做一综述，包括Ca2+信号产生和相关组分的基因表达调控。

1 植物免疫中的Ca2+信号

1.1 Ca2+流及Ca2+通道

植物细胞识别病原体的早期信号事件之一就是Ca2+内流入细胞质。利用转水母发光蛋白的转基因拟南芥研究发现，接种病原菌丁香假单胞菌(Pst)后，胞质游离Ca2+浓度快速上升，并且在处理10 min后达到最大值。如接种无致病能力的Pst可触发HR，并引起细胞质Ca2+水平的二次增加，而接种毒性菌株无此现象。利用Ca2+通道抑制剂LaCl3阻止Ca2+内流导致HR被抑制，说明Ca2+在ETI中发挥重要作用。N-酰基高丝氨酸内酯(AHLs)是革兰氏阴性细菌胞间通讯的信号分子，近年的研究表明AHLs能介导原核细菌与其真核寄主之间的信息交流，张哲等[7]利用N-3-羰基辛酰基高丝氨酸内酯(N-3-oxo-octanoyl-homoserine lactone, 3OC8-HSL)处理拟南芥细胞，发现胞质游离Ca2+浓度瞬时升高，此外3OC8-HSL可以激活质膜Ca2+通道, 增加胞外Ca2+内流。利用不同的PAMPs如flg22、elf18以及其它植物防御诱导子处理植物进行相似的研究，发现不同PAMPs和诱导子诱导细胞质Ca2+发生不同变化[8]。并且这种特异性变化不仅发生在细胞质中，同时也发生在细胞核、线粒体或者叶绿体中，表明整合了所有细胞器构建植物防御系统[9,10]。

为了解调控Ca2+通道的关键组分，Ranf等利用化学诱变剂处理转水母发光蛋白的转基因拟南芥，制备突变体库，用于分离flg22处理后表现出Ca2+信号混乱现象的突变体植物[14]。根据突变体的Ca2+信号表型，分离筛选PTI中可能参与调控Ca2+信号的关键因子。环核苷酸门控通道(CNGCs)是控制Ca2+穿过细胞膜的非选择阳离子通道[11]。突变拟南芥中CNGC2或者CNGC4基因导致HR反应减弱[12]。另外，利用cngc2突变体研究表明CNGC2在植物—病原体相互作用过程中促进胞外Ca2+的内流。ACAs是自我抑制型Ca2+-ATP酶，负责Ca2+的外流。破坏拟南芥Ca2+—ATP酶(ACA)家族中的一些成员，植物免疫会发生改变。拟南芥含有14种ACA，其中有10种位于不同细胞膜上。将液泡膜上的Ca2+泵ACA4和ACA11敲除可导致高频率的HR样坏死斑发生率显著提高，这种现象可能是由防卫水杨酸(SA)浓度升高引起的。破坏位于细胞质膜上的ACA8或者ACA10使植物对Pst毒性菌株的敏感性增强[13]。研究发现，病原菌处理的包括ACA12和ACA13在内的其它ACAs的表达也被诱导，说明在病原菌感染过程中ACAs的其它成员也参与Ca2+的稳态调控[14]。以上这些实验证据表明病原体刺激植物时，Ca2+通道和Ca2+泵调控Ca2+流的变化，而扰乱Ca2+稳态能够影响植物的防卫反应。

1.2 CaM调节Ca2+通道活性

CaM在调节Ca2+通道和Ca2+泵的过程中起重要作用。CaM同时调节CNGCs和ACAs,猜测CaM可能在Ca2+转运系统中处于中心位置。CaM激活环核苷酸产生，环核苷酸激活CNGCs，而CNGCs又可与CaM结合，且结合位点与环核苷酸结合位点有部分的重叠。CaM的结合干扰了环核苷酸的结合从而导致CNGCs失活。因此CaM反馈抑制CNGCs活性，阻止Ca2+内流。ACAs属Ca2+-ATP酶的亚族，受CaM调节，其N端含有CaM结合域和自抑制域[15]。CaM通过阻止ACAs的自我抑制从而激活Ca2+泵。ACAs活性也可以被N末端磷酸化作用所抑制。在ACA8中，存在于CaM结合域周围的一些丝氨酸残基发生磷酸化作用之后，CaM的诱导活性明显降低[16]。此外，蛋白激酶可能参与ACAs的调节。flg22处理拟南芥，ACA8和ACA10均发生不同程度的磷酸化作用，还发现ACA8可以和flg22受体激酶(FLS2)组成复合体，说明鞭毛感知系统可能直接调控Ca2+泵[17]。有研究表明，几种Ca2+依赖蛋白激酶是植物响应中的重要调节因子。ACAs是否是Ca2+依赖蛋白激酶的作用底物有待证实。ACAs的激活和失活是通过两种不同的Ca2+感受蛋白调控的，进一步说明了Ca2+转运系统反馈控制中Ca2+的重要性。

2 植物免疫中CaM亚型和CMLs的功能

2.1 CaM/CML参与植物免疫

与动物不同，植物基因组一般含有编码一些典型CaM亚型的CaM基因以及CaM类蛋白(CMLs)的基因。例如拟南芥基因组中含有9个CaM基因和50个CMLs基因。越来越多的证据表明下调CaM/CMLs基因表达或CaM/CMLs功能缺失会严重影响植物的免疫机能。下调烟草中受病原物诱导的CaM亚型基因，如NtCaM1，NtCaM13表达量，在不同程度上影响烟草的抗病性。沉默NtCaM13使烟草对病毒、病原细菌和真菌的感病性增加，而缺失NtCaM1对烟草的抗病性无影响。过表达辣椒CaM1激活活性氧和NO产生，诱导HR和防卫相关基因表达导致对病原细菌的局部抗性[18]。敲除西红柿中的CML基因APR134导致HR受到抑制，然而过表达拟南芥中APR134同源基因CML43则增强HR。拟南芥CML24敲除突变体对Pst无毒株的HR反应明显减弱，同时当用PAMPs之一的脂多糖处理时该突变体体内NO的产生明显减少[19]。拟南芥CML9突变植株和过表达植株的研究表明CML9在植物免疫反应中发挥重要作用。其它遗传学研究表明烟草CML蛋白rgs-CaM(基因沉默的调节子)在植物抗病防卫反应中通过调节RNA沉默起作用[20]。这些研究结果为CaM亚型和CMLs参与植物免疫提供了强有力的证据。

2.2 CaM及其结合蛋白

蛋白互作分析表明CML9可以像CaM一样与许多转录因子在内的多种蛋白相互结合[21-23]。其中部分蛋白是特异性结合CML9以及与CMLs密切相关的蛋白，而另外部分蛋白还可与CaM结合。WRKYs和TGAs是与植物抗病相关的两类转录因子，CML9与这些转录因子相互作用，但是CML9对其活性的影响还不清楚。与细胞自噬相关的半胱氨酸蛋白酶ATG4是一种专一结合CML24的蛋白[24]。对比分析cml24突变体和野生型中ATG4的活性表明CML24在调节ATG活性方面有重要作用。敲除atg的突变体其HR反应受抑制，与cml24的表型一致[25]，猜测ATG4b可能是HR中CML24的靶标蛋白。当植物受到病毒侵染时，植物RNA沉默机制诱导启动，将病毒双链RNA裂解为短链干扰RNA，进而沉默病毒RNA的表达[26]。然而另一方面，病毒通过病毒RNA沉默抑制子(RSSs)与siRNA的结合阻止病毒RNA的沉默，从而削弱植物的防卫反应。最近研究发现烟草CML(rgs-CML)不仅参与病毒诱导的植物RNA沉默机制，而且可以与人相互作用。在烟草细胞中rgs-CaM可以检测到病毒RSSs，并与其直接结合，从而抑制了siRNA与RSSs的相互结合，促进RSSs自身降解，增强植物防卫反应。这些结果表明介导的植物免疫可以通过结合蛋白与病原菌相互作用而完成。

2.3 CaM亚型及其转录因子

植物防卫系统的构建依赖于大量基因的表达发生变化以使细胞的防卫反应成为优势功能，而这需要许多转录因子(TFs)的协同作用使基因转录重编程协调一致[27]。Galon等已在多种DNA结合蛋白家族中分离鉴定出CaM结合TFs，包括植物特有的TF家族[28]。功能分析表明，一些CaM结合TFs在植物免疫中发挥关键作用[29]。例如一些CaM结合TFs参与Ca2+信号和水杨酸(SA)介导的植物免疫反应[30]。ICS1和EDS1是参与SA的生物合成，病原菌诱导这两种基因表达量上调，产生SA。研究发现CaM结合TFs分别正负调控ICS1和EDS1的表达。CBP60g是植物特有的CaM结合TFs，敲除cbp60g的突变体表现出病原菌诱导的SA产生量减少和ICS1表达量降低，同时对Pst的敏感性增强[31]。利用不能与CaM结合的突变的CBP60g互补cbp60g突变体，并不能恢复SA的产生和防卫反应，表明CaM在CBP60g控制可SA合成和防卫反应过程中发挥着关键作用。另有研究表明，CBO60g和同一TFs家族的另一成员SARD1在植物感染病原菌后，可以结合到ICS1基因的启动子区域，说明TFs直接调控ICS1转录[32]。EDS1是另一种正调节SA水平的基因，受CaM结合转录激活子CAMTA3的负调控EDS1的表达。植物缺失CAMTA3，SA水平上升，EDS1表达量增多并表现组成性防卫反应[33]。 类似于CBP60g，CAMTA3控制SA产生和防卫反应需要结合CaM。此外，CAMTA3可以结合到EDS1的启动子区域抑制其表达。以上结果显示CaM结合TFs对涉及SA合成的两个基因具有不同的调节作用，是病原菌诱导植物产生SA的关键调节因子。这样Ca2+/CaM信号系统既可以促进SA合成以及依赖SA的防卫反应，同时防止出现激素过量积累导致的有害效应。最近研究报道了其它CaM结合TFs在植物防卫反应中也具有正调控或者负调控的作用，例如TGA、WRKY、MYB和NAC家族中的部分成员，但是CaM对这些TFs功能的影响却知之甚少[28,30]。总之，CaM正调控或者负调控防卫反应，表明CaM在调节植物免疫中具有关键性作用。

3 结论和展望

尽管科学家们对植物CaM进行了多年的研究，但对植物中CaM/CML介导的信号转导还知之甚少。近年通过对基因敲除突变体表型分析的方法明确了个别CaM亚型和CMLs的部分生物学功能。但由于植物中CMLs的多样性，要了解每种CML的生物学功能是很困难的。利用基因表达分析、蛋白质亚细胞定位以及靶标蛋白的分离鉴定将会为鉴定CMLs不同功能和在Ca2+信号转导途径中的作用提供有价值的信息。鉴于CaM/CML家族的不同成员以及其它种类的Ca2+结合蛋白(CPKs、CBLs等)经常在相同生理过程中起作用，需要进一步探究这些Ca2+信号系统是如何相互联系的。此外，Ca2+信号途径也与其它信号转导途径相互关联，因此信号与激素介导的信号转导网络已成为研究热点。

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