响应面法优化鱿鱼缠卵腺糖蛋白 提取工艺研究

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(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002;2. 福建省水产研究所,福建厦门 361013)

鱿鱼营养丰富,富含多种人体必需氨基酸,是一种高蛋白、低脂肪、低热量,深受人们喜爱的水产品。其含有多种人体必需的氨基酸,且必需氨基酸组成接近全蛋白[1],具有缓解疲劳、滋补、抗衰老、抗氧化、养颜等作用。近年来,鱿鱼加工产量日益扩大,但在加工过程中一般仅对其酮体进行加工,产生50%左右的内脏等副产物,其中生殖腺(缠卵腺、精巢、卵巢等)占了鱿鱼内脏的20%～30%。鱿鱼加工副产物中含有大量具有高价值、含量大的功能活性成分,现已逐渐被开发和高值化利用,如林彩平等[2]以鱿鱼内脏为原料,研究了酶法提取鱿鱼肝油的生产工艺;宋茹等[3]采用酶解法提取了鱿鱼墨囊中的墨黑色素;章建设等[4]从鱿鱼内脏中提取了糖蛋白,具有一定的免疫活性。缠卵腺在头足类中普遍存在,位于直肠两侧内脏囊壁上,墨囊的两侧,呈白色卵状,与头足类的生殖活动密切相关[5]。国内外对于头足类缠卵腺的研究很少。Yu等[6]在柔鱼Ommastrephid squid的缠卵腺中发现一种特殊的海洋粘蛋白,用制成高保湿和皮肤保护的化妆品。糖蛋白是一类由寡糖链与肽链中的一定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成的蛋白质,具有调节免疫、降血糖、抗肿瘤、降血脂、抗氧化等多种生物活性。因此,本文以鱿鱼的加工副产物缠卵腺为原料,通过单因素结合响应面分析方法研究优化糖蛋白的最佳提取工艺,为鱿鱼加工副产物的高附加值利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱿鱼缠卵腺(秋季产) 福建省闽南水产有限公司提供,除去外层薄膜后分装,冻藏于-18℃;NaOH、NaBH4、无水乙醇、NaCl、苯酚、浓硫酸、酒石酸钾钠、硫酸铜、无水碳酸钠等 国产分析纯。

5804R离心机 德国艾本德(eppendorf)公司;LET132胶体磨 深圳市雷通实业有限公司;752型紫外可见光分光光度计 上海光谱仪器有限公司;大盘面磁力搅拌器 德国IKA实验室技术公司;XW-80A旋涡混合器 上海康华生化仪器制造有限公司;LGJ-12冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司;2ZX-2型旋片式真空泵 浙江黄岩宁溪医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 测定方法 采用苯酚-硫酸法测定糖蛋白中的总糖含量[7];Folin-酚法测定糖蛋白中的蛋白含量[8];硫酸钡比浊法测定糖蛋白中硫酸基的含量[9]。

1.2.2 鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取工艺流程 取100g预处理的鱿鱼缠卵腺,去膜后匀浆。在有一定料液比的匀浆液中添加不同浓度NaOH和NaBH4的混合液,混匀,并在不同的温度、时间条件下间隔搅拌提取,8000r/min离心10min,取上清液,经不同的醇沉倍数沉淀并透析,冻干得糖蛋白。

1.2.3 鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取工艺参数单因素实验 在保持其它因素相同条件下,分别考察不同的NaOH浓度、NaBH4浓度、液料比、提取时间、提取温度、醇沉倍数等各因素对鱿鱼缠卵腺糖蛋白得率、总糖、蛋白质和溶解度的影响。重复进行3次平行实验,取平均值进行统计分析。

1.2.3.1 NaOH浓度的选择 液料比30∶1,NaBH4浓度0.1mol/L,加入0.05、0.1、0.4、0.7、1.0、1.5mol/L浓度的NaOH,4℃提取4h,8000r/min离心10min,取上清,加入1倍无水乙醇醇沉,取沉淀透析,冻干,测定缠卵腺糖蛋白的得率。

1.2.3.2 NaBH4浓度的选择 液料比30∶1,NaOH浓度0.4mol/L,加入0、0.1、0.2、0.3、0.4mol/L浓度的NaBH4,4℃提取4h,8000r/min离心10min,取上清,加入1倍无水乙醇醇沉,取沉淀透析,冻干,测定缠卵腺糖蛋白的得率。

1.2.3.3 液料比的选择 NaOH浓度0.4mol/L,NaBH4浓度0.1mol/L,分别加入10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1的提取缓冲液,4℃提取4h,8000r/min离心10min,取上清,加入1倍无水乙醇醇沉,取沉淀透析,冻干,测定缠卵腺糖蛋白的得率。

1.2.3.4 提取时间的选择 液料比30∶1,NaOH浓度0.4mol/L,NaBH4浓度0.1mol/L,4℃条件下分别提取0.5、1、2、3、4、5h,8000r/min离心10min,取上清,加入1倍无水乙醇醇沉,取沉淀透析,冻干,测定缠卵腺糖蛋白的得率。

1.2.3.5 提取温度的选择 液料比30∶1,NaOH浓度0.4mol/L,NaBH4浓度0.1mol/L,分别在4、15、25、35、45℃下提取时间4h,8000r/min离心10min,取上清,加入1倍无水乙醇醇沉,取沉淀透析,冻干,测定缠卵腺糖蛋白的得率。

1.2.3.6 醇沉倍数的选择 液料比30∶1,NaOH浓度0.4mol/L,NaBH4浓度0.1mol/L,4℃提取4h,8000r/min离心10min,取上清。分别加入0.8、1、2、3、4倍的无水乙醇醇沉,取沉淀透析,冻干,测定缠卵腺糖蛋白的得率。

1.2.4 提取工艺响应面优化实验 根据单因素实验,设计以提取时间(A)、提取温度(B)和NaOH浓度(C)3个主要因素为自变量进行组合优化,提取率(Y)为响应值,采用Box-Benhnken中心组合模型进行响应面分析,共15个实验点。实验设计安排如表1。

表1 Box-Benhnken实验因素水平表Table 1 Box-Benhnken test factor-levels Table

2 结果与分析

2.1 NaOH浓度对提取率的影响

从图1可以看出,在一定范围内,随着NaOH浓度的增加,鱿鱼缠卵腺糖蛋白的提取率呈先升高后下降的趋势,提取率在NaOH浓度0.4mol/L时达最高,为11.9%。当NaOH浓度较低时,糖蛋白富集程度较低,提取率也就较低;NaOH浓度过高时,高浓度碱会使糖链断裂而破坏糖蛋白的结构[10],从而导致提取率的降低。因而选择NaOH浓度为0.4mol/L作为响应面优化的参数。

图1 NaOH浓度对糖蛋白提取率的影响 Fig.1 Effect of NaOH concentration on extraction ratio of glycoprotein

2.2 NaBH4浓度对提取率的影响

NaBH4具有还原性,可以防止糖链发生过度β-消除反应,减少糖链的断裂,从而达到保护糖链的目的,且其强还原性可将羰基、醛基还原为羟基[11]。NaBH4浓度对鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取率的影响如图2所示,提取率随着NaBH4浓度的增加呈上升的趋势,但是在实验过程中,提取的鱿鱼缠卵腺糖蛋白的溶解度却随着NaBH4浓度的升高而逐渐减小,当NaBH4浓度达到0.4mol/L时,溶解性很差。因此,综合考虑溶解度和提取率,确定NaBH4浓度为0.1mol/L。

图2 NaBH4浓度对糖蛋白提取率的影响 Fig.2 Effect of NaBH4 concentration on extraction ratio of glycoprotein

2.3 液料比对提取率的影响

液料比对鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取率的影响如图3所示。从图3中可以看出,当液料比10∶1时提取率较低,随着液料比增加到20∶1时,提取率大大升高,之后略有降低,但无明显变化。由于液料比较低时,提取液中的NaOH的含量相对偏低,使得糖蛋白无法充分富集,在醇沉时也相对不易收集,导致提取率较低。同时,低液料比处理组在造成提取率较低的现象。液料比低于30∶1,匀浆时很粘稠,离心难以质液分离,不好操作,综合实验操作难易情况选取30∶1作为提取的液料比。

图3 液料比对糖蛋白提取率的影响 Fig.3 Effect of ratio of water/material on extraction ratio of glycoprotein

2.4 提取时间对提取率的影响

从图4可以看出,随着提取时间的延长,糖蛋白的提取率也随着增加,当提取3h时提取率达最高,之后变化不明显。可能是因为β-消除米氏加成反应在较短的时间内无法充分进行,从而影响糖蛋白的富集;当达到一定时间后,反应已充分完成,提取率就趋于平衡。因此,确定糖蛋白的提取时间为3h。

图4 提取时间对糖蛋白提取率的影响 Fig.4 Effect of extraction time on extraction ratio of glycoprotein

2.5 提取温度对提取率的影响

提取温度对鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取率的影响如图5所示,随着温度的升高,提取率逐渐下降,因为较高的温度会加剧β-消除米氏加成反应的发生,从而造成糖链的断裂,小分子糖蛋白在50%的乙醇中难以沉淀,提取率降低;并且溶解度随温度的升高而增大。因此综合考虑经济成本及溶解度因素,确定在室温25℃下进行鱿鱼缠卵腺糖蛋白的提取。

图5 提取温度对糖蛋白提取率的影响 Fig.5 Effect of extraction temperature on extraction ration of glycoprotein

2.6 醇沉倍数对鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取率的影响

采用无水乙醇沉淀物质时,当乙醇浓度为50%～60%时,可用来沉淀粘液质、淀粉等大分子物质,浓度达到75%可沉淀蛋白质等,当达到80%以上时,基本可以沉淀所有的蛋白质、多糖和无机盐等[12]。从图6中可以看出,随着乙醇添加量的增加,提取率逐渐升高,当添加量超过1倍后,提取率增加缓慢。当添加0.8倍乙醇时,沉淀效果较差,不易收集;当乙醇添加量增加至1倍时,醇沉效果好且不需离心即可捞起沉淀进行收集;当乙醇添加量继续增加时,提取物可能有无机盐、蛋白质、多糖等杂质。因此,选择乙醇添加量为底物体积的1倍。

2.7 响应面法优化鱿鱼缠卵腺糖蛋白的提取工艺

2.7.1 回归模型的建立及显著性检验 在单因素实验的基础上,综合考虑溶解性及操作方便性,选取主要影响因素提取时间(A)、提取温度(B)和NaOH浓度(C)为响应因子,利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Benhnken中心组合设计法设计响应面,实验设计与结果如表2所示。

表3 回归模型的方差分析结果Table 3 Variance analysis of the regression model

图6 不同醇沉倍数的糖蛋白得率 Fig.6 Effect of ethanol adding volume on extraction ratio of glycoprotein

根据响应面统计方法对实验数据进行拟合,得到关于提取时间、提取温度和NaOH浓度的编码方程式:Y=12.47+0.078A-0.20B-0.66C-7.500E-3AB+2.500E-3AC+0.13BC-0.096A2+0.13B2-3.72C2。由编码方程一次项回归系数的绝对值大小可以得到各响应因子对响应值的影响程度依次为:NaOH浓度(C)>提取温度(B)>提取时间(A)。

建立响应值对自变量编码值的二次回归实际模型方程为:Y=12.43324+0.69417A-0.38408B+28.37546C-1.50000E-3AB+8.33333E-3AC+0.083333BC-0.095833A2+5.26667E-3B2-41.37037C2。为检验方程的有效性,利用分析软件进一步对其进行方差分析,结果见表3和表4。

由表3二次回归模型的方差分析结果可见,该模型显著性检验p<0.0001,有统计学意义,能很好地解释数据的差异性。3个自变量中B和C对鱿鱼缠卵腺糖蛋白的提取率影响显著(p<0.05),C2对鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取率的影响极显著(p<0.01),A2、B2和各因素交互作用对提取率的影响均不显著(p>0.05)。

该模型失拟项显著性水平p=0.2363不显著(p>0.05),说明回归方程对实验点的拟合度较好。从表4可信度分析结果可以看出,模型预测R2(Pred R-Square)=0.9445,表明该模型可以较好地预测新观测值的好坏;R2(R-Square)=0.9960,表明该模型对实验点的适配度达到99.6%,具有较高的拟合度;修正R2(Adj R-Square)=0.9887,表明该模型能解释98.87%实验数据的变异性。同时R2(R-Square)与修正R2(Adj R-Square)接近,更说明该模型拟合程度好,具有可靠性,适合对鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取工艺进行分析和预测。

表2 响应面实验方案与实验结果Table 2 Schedule of response surface methodology and corresponding experimental results

表4 回归模型的可信度分析Table 4 The credibility analysis of the regression model

2.7.2 响应面分析 图7反映的是响应函数与变量间的影响效应。在一定的因素水平范围内,鱿鱼缠卵腺糖蛋白的提取率随着NaOH浓度和时间水平的增大而增加,但随着因素水平的进一步增大,提取率反而降低。然而,提取率随着温度的升高反而降低。高温加剧了β-消除米氏加成反应,可能破坏糖链和使蛋白变性,从而影响提取率。

图7 各因素交互作用的响应面图 Fig.7 Responsive surface of interaction between factors

运用回归模型优化的鱿鱼缠卵腺糖蛋白的最佳提取工艺为:提取时间3.44h,提取温度25℃,NaOH浓度0.37mol/L,预测鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取率为12.85%。

2.7.3 验证实验 为了实验方便将响应面法优化的实验条件修改为:提取时间3.5h,提取温度25℃,NaOH浓度0.37mol/L。该条件下重复3次,提取率分别为12.75%、12.80%、12.81%,平均12.79%,相对误差为0.47%,说明通过响应面优化得到的最佳工艺参数有效、可靠,能较好地模拟鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取工艺,预测提取率。

2.8 鱿鱼缠卵腺糖蛋白基本成分测定

根据响应面优化法修正的最优提取工艺提取鱿鱼缠卵腺糖蛋白,经冻干后测定其基本成分,结果见表5。从表5可以看出所提取的糖蛋白中糖含量为72.5%,超过50%的糖链,占糖蛋白组成的绝大部分,是一种高分子糖蛋白分[13]。另外,该糖蛋白中还含有3.0%的硫酸根,说明鱿鱼缠卵腺糖蛋白可能是一种在非还原末端发生了硫酸化的粘蛋白。

表5 鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取物基本成分分析Table 5 Composition analysis of the extraction of glycoprotein from squid

3 结论

通过对鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取过程中可能对实验结果产生影响的NaOH浓度、NaBH4浓度、液料比、提取时间、提取温度和醇沉倍数等6个因素进行单因素实验,确定影响鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取的最主要因素为NaOH浓度、提取时间和提取温度;以3种因素为响应因子,应用响应面法优化鱿鱼缠卵腺糖蛋白提取的最佳工艺条件,结果表明,最佳提取工艺条件为提取时间3.5h,提取温度25℃,NaOH浓度0.37mol/L,在该条件下的提取率为12.79%,与实验预测结果相符。在优化的最佳提取工艺条件下获得的鱿鱼缠卵腺糖蛋白的糖含量72.5%,蛋白含量22.7%,硫酸根含量3.0%,是一种硫酸化的粘蛋白。

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