雅致小克银汉霉的复合酶破壁工艺研究

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(1.南京工业大学生物与制药工程学院,江苏南京210009;2.南京工业大学国家生化中心,江苏南京211816)

γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)分子式为C18H30O2,分子量为 278,它是无色油状液体,不溶于水,易溶于石油醚、正己烷等非极性溶剂中,在高温条件下极易氧化。 GLA是一种ω-6多不饱和脂肪酸[1-2],具有广泛的生理活性和明显的药理作用。GLA可以降血脂,抗糖尿病,抗肿瘤,抗血栓性心脑血管疾病,预防和治疗高血压、动脉粥样硬化等[3]。GLA 还可增强人体的免疫功能,它是婴儿不可缺少的营养素之一[4]。人和哺乳动物自身却不能合成GLA,一般从天然植物中获得,但远不能满足人们的需求。在某些藻类和真菌中含有丰富的GLA,真菌发酵产GLA具有生产周期短、不受自然条件限制、占地面积小、产量稳定和含油量稳定等优点,因而现在利用真菌发酵生产亚麻酸已成为国际趋势。1986年日本和英国就能用微生物提取亚麻酸进行工业化生产,目前我国还处于研究阶段,加大力度研究微生物工业化提取亚麻酸的方法是目前研究亚麻酸的一个重要方面[5]。

GLA为胞内产物,因而必须对细胞进行破壁处理,选择合适的破壁方法可最大限度的将GLA提取出来。目前,研究者常采用的油脂提取方法主要有索氏抽提法、机械法、有机溶剂浸提法、酸热法、超临界CO2萃取法等[6-7]。索氏法的油脂得率最高,但耗时较长,用量大;超临界CO2萃取法油脂得率较索氏法略低,油脂的脂肪酸组成及含量相近,且样品需要量小,样品处理能力较索氏法大为提高,但需相应设备;有机溶剂法提取效果最差;酸热法效果较好,操作简便,但更多用于菌株筛选。目前工业中仍以经球磨机或高压匀浆处理菌体后再用有机溶剂提取的方法为主,但该方法耗能高、噪声大、并且破壁过程中容易积聚大量的热量,易对GLA造成损失。因而,寻找一种高效、节能的GLA提取工艺显得尤为重要。酶法破壁相对于传统破壁手段具有反应条件温和、能耗低、环保等优点,近年来已有许多相关文献的报道。万红贵[8]等用纤维素酶和蛋白酶复合处理三孢布拉霉优化番茄红素提取率。根据雅致小克银汉霉的细胞壁结构特征,本文研究采用碱性木聚糖酶和碱性蛋白酶复合处理雅致小克银汉霉的实用效果,旨在为工业化生产提供相应的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans) 本实验室保藏菌株;碱性蛋白酶(酶活为50000u/g)、碱性木聚糖酶(酶活为35944u/mL) 诺维信中国生物技术有限公司;氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、石油醚、正己烷、乙醇 国药集团化学试剂公司,分析纯;去离子水 同凯兆业;GLA标准品 南京奥青生物有限公司,色谱纯。

JJ-1电动搅拌器 常州国华电器有限公司;LG10-2.4A高速离心机 北京医用离心机厂;KH2200B超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司;RE-85C旋转蒸发仪 上海青浦沪西仪器厂;GZX-9140 MBE电热鼓风干燥箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;SHB-S循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司;HH-2恒温水浴锅 金坛市恒丰仪器厂;BS124S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;GC112A-1气相色谱仪 上海舜宇恒平设备有限公司;SPB-3空气泵 北京中惠普分析技术研究所;SPH-300氢气泵 北京中惠普分析技术研究所。

1.2 实验方法

1.2.1 分析方法

1.2.1.1 GLA含量测定 分别选取浓度为1、2、3、4、5mg/mL GLA标准品作为横坐标,峰面积为纵坐标,得到标准曲线。利用外标法,将样品的峰面积代入,即可得到样品GLA的含量。

1.2.1.2 菌体含水量测定 称取一定量GLA湿菌丝体置入80℃烘箱中烘至恒重,计算菌体含水量。菌体含水量计算公式如下

式(1)

式中,η为含水量,M为湿菌体质量,m为烘干后菌体质量。

1.2.1.3 GLA提取率的计算 称取一定量GLA湿菌丝体置入80℃烘箱中烘至恒重,机械破碎后以石油醚作为提取剂进行索氏提取,索提时间为8h,索提结束后用旋转蒸发仪将提取溶剂蒸发掉,得到的油脂甲酯化后,经气相色谱检测,得到GLA的含量。

称取一定量小克银汉霉湿菌丝体,按照不同方法对其进行处理后,加入适量的正己烷和乙醇提取GLA,之后用旋转蒸发仪将提取溶剂蒸发掉,得到的油脂甲酯化后,经气相色谱检测,即可得到GLA的含量。由此可得到提取率的计算公式为:

提取率(%)=一定量的湿菌体经不同方法处理后得到的GLA的量/相同量的湿菌体经素提后得到的GLA的量×100

式(2)

1.2.2 实验设计 称取一定量的雅致小克银汉霉菌丝体,在一定条件下加入一定的复合酶酶进行酶解反应,反应结束后加入一定量的正己烷和乙醇提取GLA,采用气相检测GLA并按式(2)计算提取率,考察实验过程中复合酶的添加量、酶解温度、酶解时间、酶解pH等因素,获得最佳的破壁工艺。

1.2.3 复合酶各因素实验方法

1.2.3.1 酶添加量对GLA提取的影响 称取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05g复合酶(碱性蛋白酶与碱性木聚糖酶质量比为1∶1),溶于30mL去离子水中,加入到10g雅致小克银汉霉湿菌丝体(含水量为η)中。对照实验用30mL去离子水代替。自然pH条件下,在50℃恒温水中反应4h后用正己烷-乙醇混合溶剂提取(V正己烷∶V乙醇=4∶1)。收集提取液,测定GLA含量,计算提取率。

1.2.3.2 酶解pH对GLA提取的影响 称取0.03g复合酶,溶于30mL去离子水中,加入到10g小克银汉霉湿菌丝体中,分别调节菌丝体pH,为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0。在50℃恒温水中反应4h后用正己烷-乙醇混合溶剂提取。收集提取液,测定GLA含量,计算提取率。

1.2.3.3 酶解温度对GLA提取的影响 称取0.03g复合酶,溶于30mL去离子水中,加入到10g雅致小克银汉霉湿菌丝体中,均调节pH为9.0。分别在35、40、45、50、55、60℃恒温水中反应 4h后用正己烷-乙醇混合溶剂提取。收集提取液,测定GLA含量,计算提取率。

1.2.3.4 酶解时间对GLA提取的影响 称取0.03g复合酶,溶于30mL去离子水中,加入到10g雅致小克银汉霉湿菌丝体中,均调节pH为9.0。在50℃恒温水中反应1、2、3、4、5、6h后用正己烷-乙醇混合溶剂提取。收集提取液,测定GLA含量,计算提取率。

表1 正交实验表Table 1 The orthogonal experimental design

2 结果与讨论

2.1 GLA标准曲线测定

由实验得GLA标准曲线的回归方程为Y=2112.806X-155.4546,相关系数R2=0.99726。

2.2 复合酶破壁单因素实验

2.2.1 酶添加量对GLA提取的影响 由图1可知,随着复合酶的添加,GLA的提取率与对照相比有了明显提高,但随着复合酶的量增加,提取率提高的幅度越来越不明显,出于考虑经济等因素,酶的添加量选择0.03g,即相对于湿菌体来说,酶的添加量为0.3%为宜。

图1 酶添加量对GLA提取的影响 Fig.1 Effect of addition of enzyme on GLA extraction

2.2.2 酶解pH对GLA提取的影响 由图2可知,当pH为9时,复合酶的破壁效果最好,GLA提取率为86.2%。这是由于pH为9时复合酶的综合活性最佳,能最大程度上破坏雅致小克银汉霉的细胞壁,这使得萃取剂能够很好地和胞内的GLA接触,将其提取出来。在其他pH范围内,复合酶的活性受到不同程度的抑制,使得提取率有着不同幅度地下降。

图2 酶解pH对GLA提取的影响 Fig.2 Effect of different pH on GLA extraction

2.2.3 酶解温度对GLA提取的影响 如图3所示,在较低温度时,提取率随着温度升高而升高,当温度超过50℃时,提取率则随着温度升高而有所降低。这是因为在较低温度时难以发挥出复合酶的全部活力,而温度太高又容易使复合酶变性,抑制其活性,故酶解最佳温度选择50℃。

图3 酶解温度对GLA提取的影响 Fig.3 Effect of different temperature on GLA extraction

2.2.4 酶解时间对GLA提取的影响 由图4可知,随着时间增加,GLA提取率有明显地提高,但是当酶解4h过后,随着时间的增加,GLA的提取率则无明显增加,综合考虑经济等因素,酶解时间为4h,此时提取率达到87.3%。

图4 酶解时间对GLA提取的影响 Fig.4 Effect of enzymolysis time on GLA extraction

2.2 复合酶破壁正交实验

由单因素实验可知,酶解pH、酶解温度、酶解时间可能会产生相互影响,有必要对提取工艺进行正交优化。在固定酶添加量的前提下,综合考察酶解pH、酶解温度、酶解时间等单因素,通过正交实验优化出最佳提取工艺。

由正交实验数据表可知,各因素对结果影响都不显著,但正交实验数据仍有意义。复合酶对雅致小克银汉霉破壁的极差大小顺序为C>B>D>A,即影响破壁效果的4个因素的主次顺序为酶添加量、酶解pH、酶解时间、酶解温度。表中最佳的组合为A1B2C2D2,而根据k值分析,最优组合为A2B2C2D2。将这两个组合实验进行验证实验,GLA提取率分别为77.8%和87.3%,故组合A2B2C2D2为最佳组合,即复合酶添加量为0.3%、酶解pH为9、酶解温度为50℃、酶解时间为4h为本文最佳条件。

表2 正交实验数据表Table 2 The orthogonal experimental result

表3 方差分析Table 3 The analysis of variance

3 结论

酶破壁法具有反应条件温和,能耗低,环保等特点,更适于工业化生产,与传统工艺相比,节约了成本,降低能耗,符合国家倡导的“低碳经济”等主题,具有积极的意义。

本文通过单因素和正交实验,得到最佳的复合酶破壁工艺条件为:复合酶添加量为0.3%、酶解pH为9、酶解温度为50℃、酶解时间为4h,在此条件下GLA提取率达到87.3%。上述实验数据可为GLA工业化生产起一定的参考作用。

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