酶法制备金针菇提取物的工艺研究

，，

(1.广东轻工职业技术学院，广东广州 510300；2.广东高校特色调味品工程技术开发中心，广东广州 510300；3.广西工学院，广西柳州 545006； 4.广州市味研生物工程科技有限公司，广东广州 510300)

金针菇富含蛋白质，还含有VB1、VB2、VC等多种维生素，且富含钙、磷、铁等多种矿物质，含有18 种氨基酸，其中有8 种是人体必需的氨基酸，占总氨基酸量的42.29%～51.17%。金针菇还含有多种具有生理活性的物质，如具有抗癌作用的多糖[1]。金针菇提取物作为一种天然、安全、营养、美味的调味基料风靡于国际市场，但在国内，研究多在于其营养和药用价值，如李娟娟[2]等人采用木瓜蛋白酶与纤维素酶复合处理，使金针菇多糖得率可达2.56%。金针菇提取物口感方面的研究很少，作为调味料使用的报道也很少见。宋超[3]通过热烫榨汁及浓缩干燥工艺得到的金针菇精具有浓郁的金针菇清香风味，但没有研究说明其营养成分及调味效果。

笔者在研究了物理方法破壁制备金针菇提取物后，研究加入外源酶破壁制备金针菇提取物，以期获得口感更佳，营养成分更全面的天然调味液。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金针菇 市售；木瓜蛋白酶800u/mg、纤维素酶1800u/mg、果胶酶1000u/mg 广州市齐云生物技术有限公司；甲醛、盐酸 广州化学试剂厂；无水硫酸铜、浓硫酸 天津市永达化学试剂有限公司；酒石酸钾钠 天津市大茂化学试剂厂；氢氧化钠 分析纯，广州市海珠化学试剂有限公司；浓硫酸 化学纯，广州市白云区良田光明化工厂；硫酸钾 分析纯，广州化学试剂厂；无水乙醇 分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；浓硫酸 95%～98%,广州市白云区良田光明化工厂；苯酚 广州富星荣化工。

S22pc型可见光光度计 西安明克斯检测设备有限公司；XO-150型超声波细胞破碎仪 南京先欧生物科技有限公司；DK-S26型电热恒温水浴锅 上海申贤恒温设备厂；SH2-DⅢ型循环水式真空泵 超杰实验仪器有限公司；pH-3便携式pH计 深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司；HJ-6多头磁力加热搅拌器 金坛良友实验仪器厂；500g摇摆试高速中药粉碎机 温岭市创力药材器械厂；数显鼓风干燥箱 上海博讯事业有限公司医疗设备厂；消化炉HYP-1020 深圳市博大精科技实业有限公司；凯氏定氮蒸馏100KJELTEC 苏州市天威仪器有限公司；电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 破壁提取方法 考虑到综合利用金针菇采摘后的废渣，以及鲜菇大量产出而价格低廉时菇农的经济利益，将鲜菇干燥延长储存期后再酶解。将金针菇及废渣洗净置于50℃烘箱中烘12h，再经粉碎机粉碎成干粉，过40目筛，置于干燥箱中备用。根据真菌细胞壁结构，选取纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶三种酶作为外源酶，考察酶解温度、pH、时间、加酶量对这三种酶破壁效果的影响，分别采用以下方式处理后，将样品冷却定容到100mL，布氏漏斗抽滤，制成样液，测定其中蛋白质、氨基酸、多糖含量(以mg/g金针菇粉计)并品尝评分。

1.2.1.1 纤维素酶酶解法 酶解温度对纤维素酶破壁效果的影响：取5g金针菇粉加入70mL水，置于烧杯中浸泡30min，调pH至4.0，加入1%的酶液，分别在40、45、50、55℃下酶解2h。

酶解pH对纤维素酶破壁效果的影响：取5g 金针菇粉加入70mL水，置于烧杯中浸泡30min，分别调pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，加入1%的酶液，置于55℃下酶解2h。

酶解时间对纤维素酶破壁效果的影响：取5g 金针菇粉加入70mL水，置于烧杯中浸泡30min，调pH至4.0，加入1%的酶液，置于55℃下分别酶解1、2、3、4h。

加酶量对纤维素酶破壁效果的影响：取5g金针菇粉加入70mL水，置于烧杯中浸泡30min，调pH至4.0，分别加入1%、2%、3%的酶液，置于55℃下酶解2h。

1.2.1.2 果胶酶酶解法 酶解温度对果胶酶破壁效果的影响：取5g 金针菇粉加入70mL水，置于烧杯中浸泡30min，调pH至3.5，加入1%的酶液，分别在45、50、55、60℃下酶解2h。

酶解pH对果胶酶破壁效果的影响：取5g 金针菇粉加入70mL水，置于烧杯中浸泡30min，分别调pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，加入1%的酶液，置于55℃下酶解2h。

酶解时间对果胶酶破壁效果的影响：取5g 金针菇粉加入70mL水，置于烧杯中浸泡30min，调pH至4.5，加入1%的酶液，置于55℃下分别酶解1、2、3、4h。

加酶量对果胶酶破壁效果的影响：取5g金针菇粉加入70mL水，置于烧杯中浸泡30min，调pH至3.5，分别加入1%、2%、3%的酶液，置于55℃下酶解2h。

1.2.1.3 木瓜蛋白酶酶解法 酶解温度对木瓜蛋白酶破壁效果的影响：取5g 金针菇粉加入70mL水，置于烧杯中浸泡30min，调pH至6.5，加入1%的酶液，分别在45、50、55、60、65℃下酶解2h。

酶解pH对木瓜蛋白酶破壁效果的影响：取5g 金针菇粉加入70mL水，置于烧杯中浸泡30min，分别调pH至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，加入1%的酶液，置于45℃下酶解2h。

酶解时间对木瓜蛋白酶破壁效果的影响：取5g金针菇粉加入70mL水，置于烧杯中浸泡30min，调pH至6.5，加入1%的酶液，置于55℃下分别酶解1、2、3、4h。

加酶量对木瓜蛋白酶破壁效果的影响：金针菇粉加入70mL水，置于烧杯中浸泡30min，调pH至6.5，分别加入1%、2%、3%的酶液，置于55℃下，酶解2h。

1.2.1.4 三种酶混合酶解法 考虑到三种酶分步加入对于条件的调节比较繁琐，而且作为天然调味液也不允许加入过多的化学试剂，笔者考察了三种酶等比例混合后同时加入的情况，从酶解温度、酶解时间、pH、加酶量这几个因素出发，设计了四因素三水平的正交试验，因素与水平见表1。

表1 三种酶混合正交法制备 金针菇提取物试验的因素水平表Table 1 Coded variables and their coded levels in orthogonal test of the three enzymes hydrolysis together to get the flammulina velutipes extract

1.2.2 检测方法 参考文献[4]中的方法。

1.2.2.1 蛋白质 采用凯氏定氮法。

1.2.2.2 多糖 采用苯酚硫酸法测总糖，DNS法测还原糖，两者相减即为多糖含量。

1.2.2.3 氨基态氮 采用双指示剂甲醛滴定法。

1.2.2.4 感官鉴定 品尝前准备好一杯漱口水，每次品尝后都要漱口，排除前一组的影响。

评定步骤：将每次抽滤完的样液，取20mL于小烧杯中，在温和的自然光下观看其色泽；摇荡小烧杯，观察其粘稠度，是否澄清；将小烧杯的样品缓缓摇动，用鼻子嗅其味道，另取样品5mL于烧杯中用水浴锅加热到50℃，再嗅其味道；将样品用吸管吸取几滴滴入舌中央，使舌头涂匀，感觉头香，然后深呼吸，感觉是否有回香。评分标准见表2。

表2 评分标准(分)Table 2 Scoring standard

2 结果与分析

2.1 温度、pH、时间、加酶量对纤维素酶酶解制备金针菇提取物的影响

温度、pH、时间、加酶量对纤维素酶酶解的影响分别如图1～图4所示。由图可知，纤维素酶作用于金针菇最好的工艺流程为：酶解温度为50℃，pH为4.0，反应时间为2h，加酶量为2%。

图1 温度对纤维素酶制备金针菇提取物的影响 Fig.1 Effect of temperature on cellulase preparing Flammulina velutipes extract

图2 pH对纤维素酶制备金针菇提取物的影响 Fig.2 Effect of pH on cellulase preparing Flammulina velutipes extract

图3 时间对纤维素酶制备金针菇提取物的影响 Fig.3 Effect of time on cellulase preparing Flammulina velutipes extract

图4 加酶量对纤维素酶制备金针菇提取物的影响 Fig.4 Effect of enzyme concentration on cellulase preparing Flammulina velutipes extract

2.2 温度、pH、时间、加酶量对果胶酶酶解制备金针菇提取物的影响

温度、pH、时间、加酶量对纤维素酶酶解的影响分别如图5～图8所示。由图可知，果胶酶作用于金针菇最好的工艺流程为：酶解温度55℃，pH为5.0，反应时间为4h，加酶量为3%。与纤维素酶相比，在同一条件下果胶酶对金针菇的作用效果要好于纤维素酶。

图5 温度对果胶酶酶制备金针菇提取物的影响 Fig.5 Effect of temperature on pectinase preparing Flammulina velutipes extract

图6 pH对果胶酶制备金针菇提取物的影响 Fig.6 Effect of pH on pectinase preparing Flammulina velutipes extract

图7 时间对果胶酶制备金针菇提取物的影响 Fig.7 Effect of time on pectinase preparing Flammulina velutipes extract

图8 加酶量对果胶酶制备金针菇提取物的影响 Fig.8 Effect of enzyme concentration on pectinase preparing Flammulina velutipes extract

2.3 温度、pH、时间、加酶量对木瓜蛋白酶酶解制备金针菇提取物的影响

温度、pH、时间、加酶量对纤维素酶酶解的影响分别如图9～图12所示。由图可知，木瓜蛋白酶作用于金针菇最好的工艺流程为：酶解温度45℃，pH为6.5，反应时间为3h，加酶量为2%。与纤维素酶、果胶酶相比，木瓜蛋白酶对金针菇的作用效果总体上要好一些。

图9 温度对木瓜蛋白酶制备金针菇提取物的影响 Fig.9 Effect of temperature on papain preparing Flammulina velutipes extract

图10 pH对木瓜蛋白酶制备金针菇提取物的影响 Fig.10 Effect of pH on papain preparing Flammulina velutipes extract

图11 时间对木瓜蛋白酶制备金针菇提取物的影响 Fig.11 Effect of time on papain preparing Flammulina velutipes extract

图12 加酶量对木瓜蛋白酶制备金针菇提取物的影响 Fig.12 Effect of enzyme concentration on papain preparing Flammulina velutipes extract

2.4 三种酶混合酶解法制备金针菇提取物的正交实验结果

将各组试验分别进行三次，取平均值，结果见表3。

表3 三种酶混合酶解正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of the three enzymes hydrolysis together

表4 三种酶混合酶解正交复证试验结果Table 4 Repeated verification of the three enzymes hydrolysis together

由表3可知，从直观分析可以分析出，在9组实验中，多糖、氨基态氮、品尝分数的最佳条件为A2B3C1D2，此条件下，蛋白质含量也较高。而由极差分析可知，蛋白质、氨基态氮、多糖、与品评的最佳组合都不一致，分别为A3B3C3D2、A3B3C1D1、A2B2C3D2和A1B3C3D2。四个因素中氨基态氮含量影响最大的是加酶量，其余影响最大的因素是酶解时间。

正交试验复证：为得到最佳工艺条件，将这几种未经试验的组合各进行三次试验复证，结果平均值如表4，综合正交及复证结果，从蛋白质、氨基态氮含量以及品评分数来看，三种酶混合正交法中最佳组合应为A1B3C3D2，但此条件下得到的多糖含量却不高，考虑到本课题旨在制备天然调味液，品评分数更为重要，故选择最佳组合A1B3C3D2，即酶解温度为40℃，pH为6.0，酶解时间为3h，加酶量为2%，此条件下得到的金针菇提取物蛋白质含量为153.80mg/g，氨基态氮含量为13.44mg/g，多糖含量为49.67mg/g，品评分数为70分。

3 结论

本实验研究了外源酶酶解法对金针菇的主要营养成分和风味的影响，综合看来，三种酶混合酶解法要明显优于单一酶解法。最后得到最佳的提取工艺为：酶解温度为40℃，pH为6.0，酶解时间为3h，三种酶混合加酶量为2%，此条件下得到的金针菇提取物蛋白质含量为153.80 mg/g，氨基态氮含量为13.44mg/g，多糖含量为49.67 mg/g，品评分数为70分。

通过单因素试验及正交试验，得到的最佳工艺下的金针菇提取物营养物质较全面，含量损失较少，但从风味上来说，还无法达到天然调味料的要求，且与物理法相比，没有明显的优势。因此，还应考虑采用物理法与酶法相结合，或多酶分步提取法，也可调整条件，使其发生适当的美拉德反应以增加风味物质的生成等。

[1] 蔡和晖，廖森泰，叶运涛，等.金针菇的化学成分、生物活性及加工研究进展[J].食品研究与开发，2008,29:171-175.

[2] 李娟娟，董文娟，郑义. 基于响应面法的复合酶辅助提取金针菇多糖的工艺优化[J]. 食品工程，2011(10):152-155.

[3] 宋超.金针菇精生产技术[J].食品工业，1994(2):35-37.

[4] 黄敏.物理法制备金针菇提取物的正交试验研究[J].食品科技，2012,37:201-204.