响应曲面法优化油茶饼粕蛋白的 超声辅助提取工艺研究

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(中国林业科学研究院木材工业研究所,北京 100091)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)系山茶科山茶属植物,是我国特有的重要食用油料作物。油茶饼粕是油茶果榨取茶油过程中产生的主要副产物,我国油茶饼粕的年产量约为40万t[1]。由于油茶饼粕中单宁、茶皂素等溶血性物质含量较高,不适宜直接用于生产动物饲料,目前利用率不高,绝大部分基本上被废弃[2]。有关文献报道,油茶饼粕是一种营养价值较高的榨油工业副产品,含有丰富的蛋白质、单宁、茶皂素以及糖类化合物等有用成分,其中蛋白质含量最高,约为15%～18%[3-4],可作为蛋白饮料、冲调食品、焙烤食品的蛋白强化剂等的蛋白质原料,具有较高的经济开发价值[5-9]。因而,对油茶饼粕蛋白的提取及科学有效利用,不仅可以抑制油茶饼粕资源的浪费,使油茶饼粕由“废”变“宝”,也为人们获取大量丰富的植物蛋白提供了一条新途径。

目前关于油茶饼粕蛋白提取的研究很少,少数几篇文献报道主要是采用“碱提酸沉淀”方法获得蛋白质,并通过正交实验确定最佳提取条件,而传统的正交实验无法获得影响因素与响应值之间明确的函数关系,从而无法获得各因素的最佳组合及最优响应值[1,8-10]。另外,超声波辅助法作为一种新兴的提取方法,可实现各种动、植物有效含量的高效提取,虽然在油脂、多糖、香味等物质的提取中已有较广泛的运用,但在油茶饼粕蛋白提取应用方面还未见报道。基于目前有关油茶饼粕蛋白提取方面研究的不足,本论文采用超声波辅助复合溶剂法提取油茶饼粕中的蛋白,运用响应曲面法优化蛋白的提取工艺条件,建立提取工艺与油茶饼粕蛋白提取率之间的数学模型,并获得最优的蛋白提取工艺参数,以期为油茶饼粕蛋白的高效提取和进一步开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

油茶饼粕 油茶果榨取山茶油后产生的副产物,140～160目,呈棕褐色,含水率为6%～8%,由中国林业科学研究院亚热带林业研究所提供;氢氧化钠、无水碳酸钠、碘化钾、盐酸、盐酸羟胺甲醇、甲基红 均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

PHS-3B型多功能酸度计 上海精密科学仪器有限公司;JJ-1型精密增力电动搅拌器 金坛科析仪器有限公司;NH-4数显恒温水浴锅 金坛荣华仪器制造有限公司;DHG-9140A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司;CENTRIFUGE MODEL 2-40A型离心机 In Top Biolab.,Inc;FTS systems冷冻干燥机 德国Stone RIDGE公司。

1.2 实验方法

1.2.1 油茶饼粕基本成分测定 水分含量测定,采用《粮食、油料检验水分测定法》(GB 5505-85);灰分含量测定,采用《粮食、油料检验灰分测定法》(GB 5505-85);粗脂肪含量的测定,采用《粮食、油料检验灰分测定法》(GB 5512-85);粗纤维含量的测定,采用《粮食、油料检验灰分测定法》(GB 5515-85);总糖量含量的测定,采用亚铁氰化钾滴定法[11];茶皂素、单宁的含量测定,根据已有文献报道的方法[12-13];粗蛋白含量的测定,离心沉淀用凯氏定氮法,上层清液蛋白含量用Folin-酚法测定,以牛血清白蛋白为标准液。

1.2.2 油茶饼粕蛋白提取方法 油茶饼粕经干燥、粉碎后过140～160目筛子,用索氏提取装置加石油醚除去油脂,低温烘干。取100g脱脂的油茶饼粕粉加入4000mL体积分数为70%的乙醇水溶液,调节溶液的pH8～11,在30～60℃的水浴中进行超声波提取,一段时间后过滤得滤液;将过滤残渣再按“100g残渣:4000mL乙醇水溶液”的比例进行二次、三次浸提。合并滤液并静置过夜,然后再进行过滤,将滤液的上清液在4000r/min的速度下离心10min,用20%的HCl将离心后得到的上清液的pH调至4.2(蛋白等电点),待沉淀出现、稳定后,将沉淀物低温冷冻干燥,最终得到油茶饼粕蛋白。

蛋白提取率(%)=(提取蛋白的质量/原料中含有的蛋白质量)×100

油茶饼粕蛋白提取的工艺流程如图1。

图1 油茶饼粕中植物蛋白的提取工艺流程 Fig.1 Technical process of protein extraction of oil-tea cake

1.2.3 响应曲面油茶饼粕蛋白提取实验设计

1.2.3.1 提取工艺参数的确定 影响蛋白提取的因素主要有料液比(原料与提取溶剂的比)、提取时间、提取温度、超声波功率、提取介质的pH。一般提取时间越长,提取温度越高,蛋白的提取率就越高。不过,当提取时间达到一定时长,蛋白提取率增加的幅度很小,甚至无明显变化;而温度提高到一定程度后,不但不会使蛋白的提取率增加,反而会造成蛋白提取率的下降,这是因为温度过高致使蛋白变性析出,在过滤时将其滤出,故使得到蛋白的质量减少,提取率降低。伍晓春等对影响油茶饼粕蛋白提取率的提取时间、提取介质pH、料液比、提取温度等工艺参数进行了研究探讨[8]。实验结果表明,在这四个影响因素中,对蛋白提取率影响的主次顺序是pH、料液比、提取时间、提取温度,并得出了这些工艺参数较合理的取值范围:pH为9～11、提取时间为30～90min、提取温度为35～60℃、料液比为1∶30～1∶50(优选为1∶40)[8]。目前,有关超声波对油茶饼粕蛋白提取率的影响研究未见文献报道,有少量报道是关于超声波辅助其他植物蛋白提取的研究,一般将超声波的功率选择在150～450W。

1.2.3.2 提取工艺实验设计方案 根据提取时间、提取介质pH、料液比、提取温度、超声功率等工艺条件对油茶饼粕蛋白提取率影响的主次因素以及对应工艺参数的合理取值范围,本实验选用提取温度、提取时间、超声波功率和介质pH作为影响油饼粕蛋白提取率的考察因素,以+1、0、-1分别代表高、中、低水平,料液比选为1∶40,各实验因素水平与编码见表1。采用中心组合旋转设计(CCRD)原理,以油茶饼粕蛋白提取率为响应值,利用Design Expert 7.0.0软件设计了四因素三水平的响应曲面分析实验,共31个实验点,其中24个析因点,7个零点,通过零点实验估计误差,并对实验结果进行分析,建立二次多项式数学模型,求解出油茶饼粕蛋白提取率最大值。

表1 实验因素水平和编码Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.4 油茶饼粕蛋白提取工艺的验证 为了验证通过响应曲面优化得出的最佳提取工艺条件及其预测提取率的准确性和有效性,在最佳工艺下进行3次验证实验,并将平均值作为最终的结果。

2 结果与分析

2.1 油茶饼粕基本成分分析

根据国家标准中规定的实验方法,对油茶饼粕的基本组成成分进行定量检测。如表2所示,油茶饼粕中主要含有16.8%粗蛋白,35.4%总糖量,13.5%粗纤维,11.7%茶皂素,8.3%单宁，3.4%粗脂肪，8.2%水分以及2.7%其它成分,其中粗蛋白含量较高,仅次于总糖量,完全有价值进行蛋白提取,其营养价值有待开发。另外,油茶饼粕中还含有茶皂素和单宁两大抗营养成分,这正是油茶饼粕不能直接利用作为动物饲料的主要原因。

表2 油茶饼粕基本成分的组成及其含量Table 2 Components of oil-tea cake

2.2 响应面实验结果分析

2.2.1 响应曲面结果的方差分析 响应曲面法实验设计方案及结果见表3。运用Design Expert 7.0软件对数据进行分析,其方差分析结果见表4。由表4中的方差分析可知,X1、X2、X3、X4、X12、X22、X32、X42对油茶饼粕蛋白提取率的影响极其显著,说明提取时间、提取温度、介质pH、超声功率是油茶饼粕蛋白提取过程中的重要控制因素,而它们之间的交互效应不显著。从表4中F值的大小可以看出,在提取时间、提取温度、超声功率、介质pH四个因素中,对油茶饼粕蛋白提取率的影响的主次顺序依次是介质pH、超声功率、提取时间、提取温度。失拟项的p值为0.1946,没有显著性意义,说明数据中没有异常点,数据准确可靠。

表3 响应曲面实验方案与结果Table 3 Response surface results of extraction process of oil-tea cake protein

2.2.2 油茶饼粕蛋白提取工艺的回归模型方程建立 运用SPSS软件对表3和表4中的结果进行统计分析,建立以X1、X2、X3、X4为自变量,油茶饼粕蛋白提取率为响应值的二次多项回归方程:

Y=69.84+3.08X1+2.18X2+4.93X3+5.21X4-0.61X1X2+0.31X1X3-0.08X1X4-0.22X2X3+0.32X2X4-0.02X3X4-5.61X12-4.96X22-6.22X32-7.85X42

其中Y为油茶饼粕蛋白的提取率,X1、X2、X3和X4分别为提取时间、提取温度、超声功率和介质pH的编码值。

为了验证二次回归模型的可信性,分别对模型的决定系数、校正决定系数、变异系数等特征参数进行分析,结果见表5。

表5 回归模型的可信度分析Table 5 Fit statistics of regression equation

由表5可以看出,回归方程的F值为32.7307,大于F值的概率(Pr>F)为<0.0001,说明回归方程本身对蛋白提取率的影响是显著的。失拟项反映的是实验数据与模型不相符的情况,本方程的失拟项p不显著(见表4),表明方程对实验拟合性良好,实验误差小。由模型可信度分析表可知,回归方程的决定系数R=0.9663,说明模型方程可以解释96.63%的实验所得油茶饼粕蛋白提取率的变化,表明方程拟合性好。决定系数和校正决定系数相近,信噪比大于4,这均说明拟合方程可靠,准确。变异系数(CV)表示实验的精确度,CV值越高,实验的可靠性越低[2]。本实验设计中CV为6.5228%,说明实验有较好的精确度和可靠性,可以用该回归方程代替真实实验点对实验结果进行分析和预测。

2.2.3 最佳提取工艺的确定及验证 利用2.2.2节中获得回归方程,分别对X1、X2、X3、X4进行求偏导,在实验范围内寻求出油茶饼粕蛋白的最大提取点及最佳工艺条件,即提取时间为68min、提取温度为48℃、介质pH为10、超声功率350W,模型预测的提取率为72.4%。

表4 响应曲面结果的方差分析Table 4 Variance analysis of response surface results

为了验证回归方程模型的可靠性,在最佳优化提取条件下进行三次平行实验,实验结果显示,三次实验提取率分别为71.8%、72.0%、72.1%,平均提取率为71.97%,与模型预测的理论值的误差仅为0.6%,说明该回归方程能真实地反映各筛选因素对油茶饼粕蛋白提取率的影响,证明用响应曲面法寻求最佳蛋白提取工艺是较为可靠的。与通过正交方法优化蛋白提取工艺相比,采用超声波辅助法提取油茶饼粕中蛋白可显著提高油茶饼粕蛋白的提取量,说明本超声波辅助提取油茶饼粕蛋白是一种高效的植物蛋白提取方法。

3 结论

本研究通过测定油茶饼粕的基本组成成分,明确了饼粕中含有可观的植物蛋白,其营养价值有待开发。采用响应曲面法对超声波辅助复合溶剂提取油茶饼粕蛋白的工艺条件进行优化,通过建立油茶饼粕蛋白提取率(Y)与提取时间、提取温度、介质pH和超声功率之间的二次多元回归模型,求解出最优油茶饼粕蛋白提取工艺条件为:提取时间68min、提取温度48℃、介质pH10、超声功率350W,模型预测提取率为72.4%。在该工艺条件下通过三次平行实验获得的平均提取率为71.97%,与模型预测的理论值的误差仅为0.6%,说明该回归方程是合理可靠的,能较好地预测油茶饼粕蛋白的提取率,具有实用价值。

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