蓖麻饼粕提取氨基酸及酸水解法优化初探

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(1.内蒙古民族大学 生命科学学院,内蒙古通辽 028000;2.内蒙古自治区高校蓖麻产业工程研究中心,内蒙古通辽 028000)

蓖麻饼粕是蓖麻籽取油后剩下的残渣,粗蛋白含量为33%～35%,是粗粮作物的3倍[1-2]。蓖麻饼粕粗蛋白中含17种氨基酸,其中谷氨酸含量最高占23%,蛋氨酸含量较低占1%左右。蓖麻饼粕是一种优质的畜禽蛋白质饲料,但由于饼粕中含蓖麻碱等毒性成分,一直以来利用的量及范围受到很大的限制,大量的蓖麻饼粕只能用于燃料烧掉。通过酸水解的方法提取蓖麻饼粕中的氨基酸能够更好的利用其中的氨基酸资源[3-7],而经过实验证明酸水解可将蓖麻饼粕中所含所有毒物全部破坏[2]。本文在传统酸水解法的基础上优化实验条件,增加从蓖麻饼粕中提取氨基酸的产量,有效降低成本,为蓖麻饼粕的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓖麻饼粕 通华蓖麻有限公司提供;氢氧化钙、氢氧化钠、活性炭、石油醚(沸程60～90℃) 均为分析纯;硫酸 包头市广源化工有限公司;定性滤纸 杭州特种纸业有限公司;所用其他试剂均为分析纯。

SHT数显恒温磁力搅拌电热套 菏泽市牡丹区大华仪器有限公司;HJ-3型恒温磁力搅拌器 山东鄄城华鲁电热仪器有限公司;DS-1高速组织捣碎机 上海标本模型厂;2XZ-1型旋片真空泵 上海玉龙真空泵厂;数显型立式旋转蒸发仪RV10 广州仪科实验室技术有限公司;PHS-3C型精密pH计 上海仪分科学仪器有限公司;HH-S28s数显恒温水浴锅 金坛市大地自动仪器厂;GL-21M大容量冷冻离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司;202-3型指针式电热鼓风恒温干燥箱 上海锦凯科学仪器有限公司;分析天平AL104 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;78-1型磁力加热搅拌器 江苏省江阴市科研器械厂;KQ-500B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 主要工艺路线

蓖麻饼粕→石油醚脱脂→酸水解→活性炭脱色→氢氧化钙中和→浓缩干燥→复合氨基酸粉

1.3 实验方法

1.3.1 蓖麻饼粕氨基酸提取 将蓖麻饼粕研磨(高速组织捣碎机研磨)成粉末状(40目),以1g:4mL的比例加石油醚过夜脱脂,取20g脱脂蓖麻饼粕粉末于250mL圆底烧瓶中,加入2mol/L硫酸120mL(组1);4mol/L硫酸120mL(组2);4mol/L硫酸180mL(组3)等3种不同浓度剂量组,110℃下恒温搅拌回流2、4、6、8、10h得到5个不同时间组的黑酱油色水解液,趁热抽滤(布氏漏斗放3层滤纸,真空泵抽滤),在滤液中搅拌加入质量浓度为150g/L的Ca(OH)2悬浮液,中和至pH10,室温放置过夜,次日抽滤记录液体总量(V0),留取一定量用于氨基酸含量测定,剩余烘干成复合氨基酸粉[8-11]。

虹吸法:将黑酱油色水解液,趁热抽滤,在滤液中搅拌加入质量浓度为150g/L的Ca(OH)2悬浮液,中和至pH为10,室温沉淀72h,虹吸(用移液器将上清移出)记录移出液体总体积(V0)。

1.3.2 氨基氮浓度测定 甲醛滴定法测定氨基氮浓度:量取甲醛20mL于烧杯中,磁力搅拌过程中,用0.05mol/L NaOH(C)标准溶液调节溶液pH至8.2;提取液5mL(V3)用60mL蒸馏水稀释后,磁力搅拌下,用0.05mol/L NaOH调pH到8.2;将上述两种液体混合,磁力搅拌5min;用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定样品液pH至9.2,记录消耗的NaOH用量(V1),以蒸馏水为空白消耗的NaOH用量(V2),待测液中的氨基氮含量(mg/mL)计算公式为:

氨基氮浓度(mg/mL)=(V1-V2)×C×14.008/V3

每样品检测3次取平均值。

1.3.3 复合氨基酸浓度公式 参照标准GB/T5511-2008《谷物和豆类氮含量测定和粗蛋白质含量计算凯氏法》中的附录C规定的氮含量换算蛋白质含量的换算系数为6.25,待测液中的蛋白质含量(mg/mL)计算公式为:

蛋白质含量(mg/mL)=(V1-V2)×C×14.008×6.25/V3

1.3.4 氨基酸提取率计算 蓖麻饼粕中蛋白质含量33%～35%[1-2],为计算方便实验中按35%计算,每次提取时使用饼粕粉末重量为均为20g,提取率(%)计算公式为:

提取率(%)={V0×(V1-V2)×C×14.008×6.25/V3}/20×35%×1000

1.3.5 提取液中17种氨基酸绝对含量测定 将组2回流6h获得产物送至中国农业科学院油料作物研究所测试中心测定17种氨基酸的绝对含量。

1.3.6 提取液中氨基酸相对含量分析 与文献中所获结果进行比对,分析不同条件对氨基酸的提取产生的影响,并利用相对含量方差法分析17种氨基酸的均衡程度。设:提取液1为采用9mol/L盐酸回流12h水解[12]所获实验结果;提取液2为本研究中组2回流6h所获结果;提取液3和提取液4为采用38%盐酸回流14h和9mol/L硫酸回流11h水解[13]所获实验结果。

2 结果与讨论

2.1 硫酸浓度对产量的影响

蓖麻饼粕粉末与硫酸体积比例(料液比)为1g∶6mL时,提取率随回流时间增加而增加(图1),组2在6h达最高值,而组1在10h达到最高值。不同的水解液具有相应的能够达到提取率峰值的回流时间,所以无需一味寻求长回流时间。

2.2 硫酸体积对产量的影响

图1显示当硫酸浓度均为4mol/L时,硫酸体积少,提取率更高,原因可能是由于产生硫酸钙过多,抽滤困难导致提取液量减少和硫酸钙对氨基酸有一定的吸附力,过多的硫酸钙吸附更多的氨基酸,导致最终提取液中氨基酸量降低。实验中经过对硫酸钙的冲洗发现洗液中含有一定量的氨基酸,最多可以达到1.22mg/100mg(每100mg硫酸钙中含1.22mg氨基酸)。

图1 硫酸浓度与硫酸体积对提取率的影响 Fig.1 Effect on the extraction rate under different concentration and volume of sulfuric acid

回流时间在8h之内组2提取率均比组1高,即使是提取率相对较低的组3在回流2h时也比组1、组2要高(图中不明显原因是硫酸钙吸附造成),可以看出硫酸分子数量越多提取率能相对较短的时间达到高值,但一定的分子数量均有相对最高提取率的回流时间,超过这个时间提取率不会增加。

实验中发现活性炭对氨基酸有一定的吸附性,会使氨基酸丢失,提取物如果用于禽畜饲料添加可以省去脱色步骤;实验中最终获得提取液的体积有小幅波动,这个原因有两方面：第一,由于氢氧化钙溶解度较低,用于中和的氢氧化钙为悬浮液,加入时不能有效控制氢氧化钙颗粒的量所致;第二是由于不能准确控制中和时的pH(pH变化较慢有时会超过10)导致液体量有小幅波动,这些都不会影响最终的提取率。

2.3 虹吸法与抽滤法对产量的影响

蓖麻饼粕粉末与硫酸体积比例为1g∶6mL,硫酸浓度为4mol/L,分别用抽滤和虹吸两种方法提取液体。虹吸法可以获得相对较高浓度的氨基酸液,但提取量少(虹吸法可获得70～140mL提取液、抽滤法可获得300～400mL提取液),留液很多,提取率降低(图2)。抽滤法能够将液体全部抽出,但提取液中氨基酸浓度降低,这可能是抽滤过程中氨基酸液在通过硫酸钙固体时,氨基酸吸附在其中的原因,可通过对硫酸钙的冲洗获得残留在其中的氨基酸。虹吸法提取氨基酸时,沉淀时间、虹吸手法等都对上清提取量有一定的影响,所以提取率有一定波动。实验中使用8mol/L做酸水解液时无法用滤纸抽滤,而用其它抽滤装置时,产生的硫酸钙又会损坏设备。所以使用抽滤法提取氨基酸时酸水解液浓度不宜过高。

表1 组2回流6h获得提取液氨基酸绝对含量Table 1 Absolute contents of the amino acids in the extract obtained from acid hydrolysis 2 with reflux time 6h

图2 抽滤法和虹吸法提取液体的提取率对比 Fig.2 Comparison of the extraction rate of filtration and siphon

2.4 提取液中17种氨基酸的绝对含量与百分比分析

蓖麻饼粕提取液中含有17种氨基酸,其中谷氨酸含量最高,蛋氨酸含量最低(表1)。提取液1、2、3、4的氨基酸组成比例有一定差异(图3),个别氨基酸在不同提取液中的含量差异较大,如胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸。胱氨酸、酪氨酸、脯氨酸在提取液2中含量与提取液1、3、4中含量相比有差异,可能与回流时间有一定关系;丝氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸在提取液4中含量与提取液1、2、3中含量相比差异可能与水解液的成分、浓度和回流时间均有关系。

图3 提取液中17种氨基酸的相对含量示意图 Fig.3 absolute contents of 17 kinds of amino acids in the extract

表2可以看出提取液2中17种氨基酸含量相对更为均衡。

表2 各种提取液中氨基酸相对含量方差Table 2 The relative contents variance of various amino acids in the extract

3 结论

回流时间、硫酸浓度、硫酸体积均对产量有影响,产量达到峰值后增加回流时间不会增加氨基酸产量。酸水解液中提高硫酸浓度或增加硫酸体积,提取速率会增加,但如果过高,会因产生硫酸钙量增加而产量减少,并且过高的硫酸浓度会影响抽滤过程。通过水洗沉淀物(硫酸钙)能够获得更多的氨基酸,从而提高产量。回流时间和水解液成分等对提取液中各种氨基酸的含量有一定影响。

通过优化酸水解方法能够提高氨基酸的产量,并且可使产物中各种氨基酸含量更为均衡。

通过降解蓖麻饼粕中的蛋白质获得氨基酸,不仅能扩大蓖麻饼粕的应用范围,而且为蓖麻蛋白的去毒开辟了一条新路。通过本研究获得了氨基酸提取的最佳工艺,通过分析氨基酸的组成与含量,对进一步开发和利用氨基酸资源奠定基础。

提取物的营养价值还有待于进一步进行生理实验。

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