树舌富锗深层培养研究

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(1.安徽科技学院应用微生物研究所,安徽凤阳 233100；2.嘉必优生物工程(武汉)有限公司,湖北武汉 430073)

树舌(Ganodermaapplanatum)是隶属于灵芝属的珍稀药用真菌,其子实体、菌丝体与发酵液中含有多种药用成分,具有调节机体免疫系统、抗肿瘤、抗衰老等多种药用功效,深受消费者的喜爱[1-3]。

锗虽非人体必需元素,但锗的一些化合物具有一定的生理活性和保健效果,尤其是天然有机锗化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化与降血脂等多重高度生物活性[4-6]。同时对糖尿病、关节炎、骨质疏松、慢性胃炎也有一定的治疗效果。

目前有关真菌如桦褐孔菌、蛹拟青霉、羊肚菌等的富锗研究已有相关报道[7-9],而树舌富锗培养的研究报道较少。本研究拟探讨树舌将无机锗转化为有机锗的能力及微量元素锗对树舌菌丝体中主要活性成分含量的影响,为开发富锗树舌功能性食品或药品提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

树舌(G.applanatum) 安徽科技学院应用微生物研究所保藏；腺苷 购自Sigma公司;氧化锗、磷酸氢二钾、葡萄糖、蛋白胨、无水乙醇、酵母膏、硫酸镁、浓硫酸、磷酸二氢钾等 国药集团化学试剂有限公司;斜面培养基 马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂18g,水1000mL;种子培养基 马铃薯250g,葡萄糖30g,蛋白胨5g,水1000mL;液体培养基 葡萄糖30g,蛋白胨5g,酵母粉5g,磷酸二氢钾3.0g,硫酸镁1.5g,水1000mL。

T6型紫外可见分光度计 北京普析通用仪器有限公司;QYC211型恒温振荡培养箱 上海福玛实验设备有限公司;FA1004电子分析天平 上海精科天平有限公司;5810R型冷冻离心机 Eppendorf;1525型液相色谱仪 Waters;TAS-990原子吸收分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 树舌液体富锗培养工艺 将活化的菌丝体接入装有80mL种子培养基的250mL三角瓶中,置于恒温振荡器上28℃培养5d得到摇瓶种子液。按10%的接种量接入液体培养基中进行富锗培养,培养条件:28℃、160r/min、培养7d。

1.2.2 液体培养物的处理 将培养好的醪液离心,分别收集菌丝体和上清液。上清液按文献[10]方法提取胞外多糖;菌丝体用去离水反复冲洗,直至水洗液中检测不到锗为止。菌丝体经真空冷冻干燥后称重,并按文献[2]方法提取胞内多糖。

1.2.3 多糖含量的测定 硫酸-苯酚法[11]

1.2.4 腺苷含量测定 高效液相色谱法[12]。

1.2.5 锗含量的测定 利用原子吸收法:分析波长为265.2nm,光谱通带宽为0.6nm,灯电流为8mA,进样体积为10μL。锗标准曲线:按分析条件对2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μg/mL 锗标准系列溶液进样10μL 测定,并求回归方程[13]。

1.2.6 有机锗含量测定 参见文献[14-15]将菌丝体粉碎后经透析袋透析,每天换2～3次水,将其中的无机锗透析掉,然后将浓缩的样品直接置于50mL坩埚内,于600℃灰化1h以上,冷却后用30mL体积分数0.5%硝酸少量多次清洗,转移至100mL烧杯中,在磁力搅拌器上边加热至60℃以下边搅拌,使坩埚内的灰化物完全溶解,离心分离沉淀,取上清液定容至50mL,待测定有机锗含量。有机锗转化率的计算公式:

有机锗转化率(%)=(有机锗含量/培养基中总锗含量)×100

2 结果与分析

2.1 锗对树舌生物量及有机锗转化率的影响

在液体培养基中添加氧化锗,设置8个不同的浓度,探讨树舌对锗的耐受特性,结果如图1所示。由图1可知,树舌具有较强的耐锗能力,并且在一定的浓度范围内锗对树舌菌丝体的生长具有很好的促进作用,当锗浓度度为250μg/mL时,菌体生物量最大,达到15.44g/L,是空白对照的1.38 倍。但锗浓度大于250μg/mL时,随其浓度的增大,生物量呈直线下降。由图2可知在一定浓度范围内菌丝体中有机锗的含量随着培养基中锗浓度的增大而增加,且有机锗转化率随之增加,当锗浓度为250μg/mL时,有机锗转化率达最高为2.35%。当锗浓度大于250μg/mL时,菌丝体中有机锗含量增加不明显,且有机锗转化率不断降低。经方差分析可知锗浓度对菌丝体中有机锗含量及有机锗转化率有显著影响。

2.2 锗对树舌胞外多糖含量的影响

由图3可知,低浓度的锗对树舌胞外多糖合成有明显的促进作用。当培养基中锗浓度为150μg/mL时,胞外多糖含量最多,达到了1.12g/L,是空白对照的1.37倍。方差分析可知,在锗浓度为150μg/mL时与空白对照相比,对胞外多糖产量有显著影响。当锗浓度大于150μg/mL时,胞外多糖含量逐渐降低,并且比空白对照的胞外多糖含量还要低,说明高浓度的锗对胞外多糖的合成有抑制作用。

图1 锗对树舌生物量的影响 Fig.1 Effect of germanium on the biomass of G. applanatum

图2 锗对树舌菌丝体有机锗转化率的影响 Fig.2 Effect of germanium on conversion rate of organic germanium in mycelia of G. applanatum

图3 锗对树舌胞外多糖含量的影响 Fig.3 Effect of germanium on the content of extracellular polysaccharide of G. applanatum

2.3 锗对树舌胞内多糖含量的影响

从图4可以看出,低浓度的锗对菌丝体胞内多糖的生成有明显促进作用,且比对胞外多糖合成的促进作用更强。在培养基中锗浓度为250μg/mL时,胞内多糖产量最高,达到了24.88mg/g,是对照组的1.76倍。当锗浓度大于250μg/mL时,胞内多糖含量逐渐降低。但在实验的浓度范围内依然存在一定的促进作用。在锗浓度为350μg/mL时,胞内多糖含量为18.18mg/g,是对照组的1.28倍。方差分析可知锗对胞内多糖产量有显著促进作用。

图4 锗对树舌胞内多糖含量的影响 Fig.4 Effect of germanium on the content of intracellular polysaccharide of G. applanatum

2.4 锗对树舌菌丝体腺苷含量的影响

从图5可以看出,锗浓度对菌丝体腺苷含量具有显著的影响。锗浓度在250μg/mL时,腺苷含量达到最高为1.41mg/g,是空白对照的2倍,小于该浓度时菌丝体中腺苷含量随着锗浓度的增加而不断增加,当锗浓度高于250μg/mL时腺苷含量开始下降,在锗浓度350μg/mL时,菌体的腺苷含量还比对照组高,是对照组的1.1 倍。

图5 锗对树舌菌丝体腺苷含量的影响 Fig.5 Effect of germanium on the content of adenosine from G. applanatum

3 结论

有机锗具有高度的生物活性,可以通过大型真菌进行富集而获得。本研究结果表明,培养基中加入适量的锗对菌丝体中生物活性物质的含量有显著的提高作用,在锗浓度为250μg/mL时,生物量、菌丝体中有机锗、胞内多糖和腺苷含量较对照组均有显著提高。该研究结果与陈宏伟等对蛹虫草研究较为一致,在一定的锗浓度范围内对菌丝体的生长及胞内多糖和腺苷合成有显著促进作用,最适添加量在200～300μg/mL;当锗浓度过高时反而有抑制作用,但是两者对有机锗的转化率有一定的差别,本实验中树舌有机锗最高转化率为2.35%,而蛹虫草达有3.7%[14]。而胞外多糖的产量在锗浓度为150μg/mL时达到最高,这与陈石良等[16]对灰树花富锗培养研究有所不同。另外,黄晓冬、李秋蕊等人对桦褐孔菌、羊肚菌的研究有所不同的是最适添加量较低分

别为40、100μg/mL,说明不同菌体对锗的耐受力及有机化能力存在差异。本研究为开发富锗树舌功能性食品或药品奠定了基础,菌丝体中有效成分含量的提高以及锗元素的富集可能会提高产品对人体的保健功能,实际效果如何还需进一步通过药理及毒理实验进行研究。

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