淀粉液化芽孢杆菌BS5582产蛋白酶的酶谱分析与鉴定

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(1.江南大学教育部工业生物技术重点实验室,江苏无锡 214122;2.江南大学酿酒科学与工程研究室,江苏无锡 214122)

淀粉液化芽孢杆菌能高水平分泌多种胞外酶,如淀粉酶、葡聚糖酶和蛋白酶,是一类重要的工业生产菌株[1-2]。淀粉液化芽孢杆菌BS5582是一株经过人工诱变筛选高产蛋白酶的菌株[3]。万岩松[4]对该菌株所产蛋白酶性质进行研究,表明在啤酒麦汁糖化过程中添加其所产蛋白酶,有效增加氨基氮水平,能够应用于溶解不良的麦芽或高比例辅料的啤酒酿造[5]。淀粉液化芽孢杆菌能分泌中性蛋白酶和碱性蛋白酶[6],鉴定菌株BS5582蛋白酶酶系组成,能更好地理解这些蛋白酶之间可能存在的协同作用机制,在实际应用中具有重要意义。

基于凝胶电泳的酶谱分析是一种快速分离分析混合样品中不同性质的酶,包括蛋白酶、纤维蛋白溶解酶[7]和木聚糖酶[8],此外也能够快速检测蛋白酶抑制剂[9-10]。其中,蛋白酶的酶谱分析是通过非变性SDS-PAGE电泳分离蛋白酶,并将凝胶浸没在蛋白底物(明胶或酪蛋白)中使蛋白酶水解底物,通过染色显示蛋白水解条带,即形成蛋白酶酶谱,也称为substrate-SDS-PAGE[10]。Fernando L. Garcia-Carreno[10]分析该方法检测蛋白酶的灵敏度,同时还能够检测到浓度低至12ng的蛋白酶抑制剂。而Sung Goo Park[7]将该方法结合双向电泳的酶谱方法检测了枯草芽孢杆菌的纤维蛋白水解酶。蛋白酶酶谱还可用于分析纯化后的蛋白酶的纯度和种类[11]。朱美娟[12]报道了应用该方法研究金线鱼消化道不同部位蛋白酶的活力分布规律及不同体重对蛋白酶活力分布的影响,为金线鱼消化道蛋白酶的回收、纯化及应用提供理论依据。为了采用酶谱方法能够快速鉴定蛋白酶,Daniel Pan[13]改进了蛋白酶酶谱方法,增加蛋白酶转印步骤,可实现蛋白酶的酶谱分析及鉴定。

质谱技术能够快速鉴定蛋白质,将各种蛋白质与序列数据库联系起来,成为鉴定蛋白质及多肽的首选方法[14-15]。该方法将胶上蛋白质经酶解后得到一组片段,经质谱测定后获得肽段的氨基酸序列,通过数据库搜寻鉴定出该种蛋白质[16]。该方法灵敏度高,分析迅速,已成为蛋白质组学研究中必不可缺的关键技术之一。

本研究采用酶谱分析法和质谱鉴定的分析手段,对BS5582产蛋白酶进行分析和鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)BS5582 本研究室保藏菌株;种子培养基(g/L) 蛋白胨10.00,牛肉膏5.00,NaCl 5.00,pH7.0;发酵培养基(g/L) 玉米粉50.00,豆饼粉40.00,KH2PO43.00,Na2HPO4·12H2O 6.00,(NH4)2SO42.00,MgSO41.80,CaCl20.75,pH6.0。

回转式恒温调速摇瓶柜 上海福玛设备有限公司;Powerpac Basic蛋白电泳仪 美国Bio-Rad公司;Ultraflextreme串联飞行时间质谱仪 德国Bruker公司。

1.2 培养方法

1.2.1 种子培养 接种斜面菌种1环于0.1MPa灭菌20min的种子培养基中,37℃、200r/min旋转式摇床培养8h。

1.2.2 摇瓶发酵 在250mL三角瓶中,装入15mL发酵培养基,0.1MPa灭菌20min,接种量10%,于200r/min培养,培养温度35℃。

1.3 分析方法

1.3.1 蛋白酶酶活测定 根据国标GBT 23527-2009蛋白酶制剂[17],采用福林法。酶活单位定义:1.00g固体酶粉(或l.00mL液体酶)在40℃水浴,pH3.0,7.5或10.5条件下,1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位,以U/g(U/mL)表示。

1.3.2 SDS-PAGE 根据蛋白质电泳实验技术[18]使用5%(w/v)的浓缩胶和12%(w/v)的分离胶。SDS-PAGE电泳上样量5μL,非变性-SDS-PAGE和底物-SDS-PAGE(酶谱)电泳上样量15μL。其中非变性-SDS-PAGE和酶谱分析法采用Scott M. Geib[19]提出的方法,样品未经过加热以保证蛋白酶的活性在凝胶的两边加相同的样品,电泳结束后,将凝胶切割成两半,一半用于直接染色,即非变性-SDS-PAGE,另一半用于制作底物-SDS-PAGE(酶谱)。

1.3.3 蛋白酶酶谱分析方法 酶谱法是采用Anissa Haddar报道的方法[11]。电泳前样品没有经过加热,电泳后,将凝胶浸在含有2.5% Triton X-100的20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)中,洗涤凝胶两次以去除SDS,每次30min。然后用20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)洗涤凝胶三次除去Triton X-100,每次20min。然后将凝胶浸入含1%(w/v)酪蛋白的20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.5)中,40℃孵育3h。凝胶用染色液染色2h。最后脱色10min,凝胶上的空白水解条带表明蛋白酶的存在。

1.3.4 质谱分析方法 采用王鸿丽改进的质谱兼容的胶内酶切方法对蛋白条带进行质谱分析[20]。

2 结果与分析

2.1 菌株BS5582分泌的蛋白酶酶活分析

根据国标GBT 23527-2009蛋白酶酶活分析方法,使用乳酸钠缓冲液(pH3.0)、磷酸缓冲液(pH7.5)和硼酸缓冲液(pH10.5),分别检测菌株BS5582发酵48h的上清液在中性、酸性和碱性环境的蛋白酶酶活。结果如表1所示,BS5582发酵上清液的蛋白酶酶活在中性条件下最高,碱性条件下酶活只有中性条件下的12.56%,酸性条件下的酶活很低,表明菌株BS5582的蛋白酶在中性条件下活力最高。因此蛋白酶酶活分析以及蛋白酶酶谱分析均在pH7.5下进行。

表1 BS5582发酵上清液蛋白酶酶活Table 1 Protease activity of BS5582 fermentation supernatant

2.2 菌株BS5582发酵过程产蛋白酶分析

分析菌株BS5582生长与产胞外蛋白酶的关系,结果如图1所示。由此可知,在菌株BS5582发酵过程中,有三个酶活高峰,分别为24h的3815.2U/mL、33h的8588.9U/mL和48h的9987.6U/mL。因此确定该菌株可能在三种不同生长时期,高效生产不同的胞外蛋白酶,且在现有发酵条件下,其产蛋白酶周期确定为48h。

图1 BS5582产胞外蛋白酶酶活与细胞生长的关系 Fig.1 Relationship between extracellular protease activity produced by BS5582 and the cell growth

表2 蛋白酶MALDI-TOF/TOF MS/MS鉴定分析Table 2 Proteasse identified by MALDI-TOF/TOF MS/MS

当细胞开始生长,胞外蛋白酶酶活随之增加,表明菌株BS5582存在组成型的胞外蛋白酶。当细胞培养24h后,菌浓迅速下降,开始产芽孢(图2),培养基中的蛋白酶酶活迅速增加,表明此时BS5582可能快速分泌与产芽孢相关的胞外蛋白酶。进一步培养,约40h之后,胞外蛋白酶酶活再次迅速增加。此时培养基中的细胞数持续下降,所以这一阶段分泌的蛋白酶可能与细胞的裂解相关,细胞的裂解使部分胞内的蛋白酶释放到胞外。所以,菌株BS5582在一次生长的不同时期,可能分泌多种蛋白酶,且这些蛋白酶具有不同的生理功能。

图2 BS5582培养24h的细胞形态电子显微镜观察图 Fig.2 Electron microscopy of BS5582 cell morphology at 24h

2.3 菌株BS5582分泌蛋白酶酶谱分析

为了鉴定菌株BS5582分泌的胞外蛋白酶,取发酵48h的培养液上清,进行非变性-SDS-PAGE和酶谱分析实验。由于酶谱凝胶中蛋白底物的存在和样品量少的原因,因此直接用酶谱凝胶的水解条带进行鉴定成功率不高。所以,本次研究结合了未加底物处理的非变性-SDS-PAGE,电泳过程与酶谱分析进行平行电泳实验,确保非变性-SDS-PAGE上的电泳条带与酶谱分析的蛋白质条带一致。非变性-SDS-PAGE的蛋白质条带经过考马斯亮蓝染色,并对相应的条带进行质谱鉴定,结果如图3所示。图3(A)是胞外蛋白酶的酶谱凝胶分析,表明存在五条清晰的空白水解条带。因此切割了酶谱对应的非变性-SDS-PAGE上的蛋白条带进行鉴定,如图3(A)所示标记为P1、P2、P3、P4和P5为蛋白酶条带。而胞外总蛋白的变性SDS-PAGE分析如图3(B)所示,其中P6为实验室前期在菌株BS5582发酵上清中纯化的一种中性金属蛋白酶[4]。

图3 BS5582发酵上清液未经过加热处理的 非变性-SDS-PAGE和底物-SDS-PAGE(酶谱)分析(A) 及经过加热的发酵上清液的变性-SDS-PAGE(B). Fig.3 Non-denaturing-SDS-PAGE and substrate-SDS-PAGE (zymography)(A)of not heat-treated fermentation supernatant and denaturing-SDS-PAGE(B). of the heated fermentation supernatant from BS5582

2.4 蛋白酶酶谱条带的质谱鉴定

将对应于酶谱的非变性SDS-PAGE上的P1,P2、P3、P4和P5蛋白条带和变性-SDS-PAGE上的P6用无菌手术刀割下,进行质谱鉴定,鉴定结果如表2所示。

蛋白条带P1和P5经鉴定为Bacillopeptidase F(Bpr),它是一种带有酸性等电点的丝氨酸肽链内切酶[21]。但经鉴定出蛋白条带P1的分子量与预测分子量相差较大,可能该蛋白酶存在前体结构(pre-pro structure)。B.subtilis的所有胞外蛋白酶均在细胞质中以前原酶(preproenzyme)的形式合成,在细胞外环境中加工成有活性的成熟酶[22]。蛋白条带P5较P1分子量变小说明该蛋白酶可能自我剪切导致分子量变小。Carolyn A Roitsch纯化出B.subtilis的Bpr的两种形式,分子量分别为33ku和50ku,所以,Bpr呈现多种形式,表明其存在自溶机制[23]。Xu-Chu Wu将编码Bpr的基因(bpf)克隆并表达,DNA序列显示该蛋白酶是一种分子量为92ku的前体蛋白,NH2端的前30个氨基酸为信号肽,31～194氨基酸可能是前导肽。该蛋白分泌到胞外形成分子量为80ku的蛋白酶,该分子量的蛋白酶在加工过程中逐渐降解为多种有活性的形式,分子量分别为68、50和48ku,也说明Bpr存在自溶机制[24]。所以鉴定的BS5582分泌的Bpr存在多种形式可能与其自溶特性相关。Bpr具有较高的酯水解活性,能够切开羧基侧是芳香族(酪氨酸或苯丙氨酸)或疏水性氨基酸残基(亮氨酸)的肽键[25]。

经过质谱鉴定,蛋白条带P2和P4是一种胞外中性金属蛋白酶(Extracellular neutral metalloprotease,Mpr),两者分子量相差较大,而且它们与预测分子量59678u均有较大差别,这可能是由于胞外蛋白酶的成熟经过多步加工以及存在自我剪切活性[26],所以P4可能是P2自我剪切形成的。Hiroaki Shimada研究淀粉液化芽孢杆菌来源的中性蛋白酶表明其存在一个前体结构(pre-pro structure)[26],分子量减小的胞外蛋白酶是其成熟酶的形式。有报道表明Mpr的成熟需要Bpr帮助其加工[22]。本实验室前期分离纯化了BS5582的一个胞外中性金属蛋白酶(图3(B)中P6),其相对分子量约为37ku[4],是经过切除信号肽和前导肽而形成的成熟肽,其大小与P2分子量相近。这些胞外蛋白酶往往在胞内以前体形式存在,主要是抑制蛋白酶活性从而保护宿主细胞免受蛋白酶的水解[27]。中性金属蛋白酶能切开氨基端疏水性氨基酸残基或者任一氨基酸残基-Leu(-Phe及其它)之间的肽键。

蛋白条带P3经鉴定是Subtilisin Bpn’[28],是一种丝氨酸内切酶,属于蛋白酶第八家族,化活性中心由Ser221、His64和Asp32组成,碱性蛋白酶型的丝氨酸蛋白酶能够切开羧基侧是芳香族或疏水性氨基酸残基的肽键[25]。这是一种在洗涤剂工业应用广泛的碱性蛋白酶。

3 结论与讨论

淀粉液化芽孢杆菌BS5582能高效分泌胞外蛋白酶,其在啤酒酿造中具有一定的应用价值。胞外蛋白酶酶活分析表明蛋白酶在中性条件下活力最高,其发酵过程产生三个酶活高峰,表明菌株可能分泌多种蛋白酶。本次研究应用蛋白酶酶谱分析和蛋白质质谱鉴定相结合的方法,快速鉴定了胞外蛋白酶的复杂组成,表明该方法是一种快速鉴定多种蛋白酶的有效方法。但是蛋白酶酶谱也存在一些缺点,如非变性条件下,为了保证蛋白酶的活性,样品没有经过加热处理,蛋白样品难以充分结合SDS,造成酶谱分析的分子量不够准确。酶谱分析的凝胶中含有底物蛋白质,直接鉴定其条带影响质谱鉴定的准确性。本次酶谱分析的蛋白质采用非变性SDS-PAGE的蛋白质条带进行质谱鉴定,得到较好的鉴定结果。

本研究采用酶谱分析与质谱的方法快速鉴定了淀粉液化芽孢杆菌BS5582的胞外蛋白酶及其多种复杂形式,包括Bacillopeptidase F、中性金属蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶Bpn',这三种蛋白酶具有不同的偏好性酶切作用位点。Bacillopeptidase F具有较高的酯水解活性,能够切开羧基侧是芳香族(酪氨酸或苯丙氨酸)或疏水性氨基酸残基(亮氨酸)的肽键;中性金属蛋白酶能切开氨基端疏水性氨基酸残基或者任一氨基酸残基-Leu(-Phe及其它);枯草杆菌蛋白酶Bpn'能够切开羧基侧是芳香族或疏水性氨基酸残基的肽键。在以后的实验中可着重研究这三种蛋白酶的协同作用机制和该菌株蛋白酶的分泌机制,在实际应用中具有重要意义。

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