细菌ZY-H产灵菌红素发酵参数优化

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(1.河西学院农业与生物技术学院,甘肃张掖 734000;2.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室,甘肃张掖 734000;3.河西学院化学化工学院,甘肃张掖 734000)

灵菌红素是一种脂溶性天然色素,是由粘质沙雷氏菌、假单胞菌、嗜冷红弧菌[1-2]、真细菌[3]所产生的次级代谢产物,该色素具有抗真菌、抗细菌、抗疟疾、免疫抑制和抗肿瘤等多种生物活性[4-6],同时对海洋赤潮藻具有清除作用[7-8]。因此,灵菌红素在医药、环境治理和食品上具有广阔的应用前景。

目前,国内外学者对灵菌红素的发酵参数进行了大量的研究[1,3,9-12],但是由于产灵菌红素菌的分离源不同,发酵条件和培养基组成差异较大,代谢产物也不尽相同[13],这就限制了灵菌红素的产业化生产。

基于此,本研究从河西走廊张掖境内采集的芦苇根系土壤中分离出一株产灵菌红素的细菌[14],通过正交实验探讨了pH、温度、发酵时间、碳源、氮源等参数对细菌ZY-H产灵菌红素的影响,以期为该菌的开发利用提供技术资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌种来源 本实验室从张掖地区芦苇根系周围的土壤中分离到产灵菌红素的菌株,编号为ZY-H;蔗糖、CaCl2、95%乙醇、盐酸 均为国产分析纯;蛋白胨、牛肉膏 均为国产生化试剂;X-5大孔吸附树脂、硅胶(200～300目) 南开大学化工厂;斜面培养基[15]蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L、琼脂15～20g/L,pH7.2～7.5;种子扩大培养基 同斜面培养基,其他成分相同,不加琼脂;PDA培养基 参考文献[15];液体发酵培养基 蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化钠5g/L,pH7.2～7.5。

760CRT双光束紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;AE200电子分析天平 Mettler Toledo公司;CR21GⅡ高速冷冻离心机 日本日立公司;VA1-2真空干燥箱 美国Shellab公司;HZP-250型全温振荡培养箱 上海精宏实验设备有限公司;旋转蒸发器RE-2000A 巩义市京华仪器有限责任公司;DHZ-D(Ⅲ)循环水真空泵 巩义市京华仪器有限责任公司;层析柱(15cm×30cm) 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 色素的提取与制备

1.2.1.1 色素的生产和提取工艺

1.2.1.2 菌体培养 从斜面培养基上挑取单菌落接种于种子培养液中,32℃、180r/min恒温培养12～16h,以2%的接种量接入发酵培养基中,在32℃、180r/min恒温培养48h;合并发酵液,在12000r/min离心10min,收集紫红色菌体。

1.2.1.3 色素的提取 在菌体中加入95%乙醇浸提至菌体无色,离心,上清液在旋转蒸发器中减压浓缩,真空干燥,然后根据文献[14]进行纯化、分离。

1.2.2 灵菌红素的测定

1.2.2.1 标准曲线的制备 准确称取纯化的色素粉末20mg,用酸性乙醇溶解并定容至10mL,准确吸取0.5mL用酸性乙醇稀释至10mL即为0.1mg/mL的色素母液。吸取色素母液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL用酸性乙醇定容至10mL,在533nm波长下测吸光度,以吸光度为纵坐标,灵菌红素的浓度为横坐标作图。

1.2.2.2 色素的测定 取1mL发酵液于4℃,10000r/min离心10min,弃上清,菌体中加入5mL酸性乙醇(95%乙醇∶1moL/L盐酸=24∶1)提取色素直至菌体无色,在4℃,10000r/min离心10min。将色素液定容至10mL,然后用酸性乙醇稀释后在533nm下测定吸光度,根据回归方程,计算每升发酵液所含灵菌红素的含量。

1.3 实验设计

在是先预做的单因素实验的基础上对影响灵菌红素产量的培养基组成碳源、氮源、氯化钙以及影响发酵条件的发酵液初始pH、发酵时间、温度、装液量和接种量做正交设计,因素水平表见表1,表2。

表1 培养基正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for culture medium

根据正交设计实验,以灵菌红素为考察指标,确定发酵培养基和培养条件对灵菌红素产量影响的最优组合。

1.4 验证性实验

根据正交实验的分析结果,对最佳优化的发酵参数进行重复5次发酵实验,以菌体浓度和灵菌红素含量为衡量指标,并与马铃薯(PDA)和牛肉膏蛋白胨培养基进行比较,来验证最佳发酵参数的可行性。

表2 发酵条件正交实验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation condition

1.5 数据处理

实验数据采用Excel 2003软件进行处理,Origin7.5软件作图,DPS12.5软件进行方差分析。

2 结果与讨论

2.1 灵菌红素的标准曲线

灵菌红素的标准曲线如图1所示,以吸光度为纵坐标,灵菌红素的浓度为横坐标作图并建立回归方程y=0.066x+0.009,R2=0.9994,y代表吸光度,x是色素的浓度(μg/mL)。根据标准曲线求得发酵过程中各个条件下灵菌红素的产量。

图1 灵菌红素标准曲线 Fig.1 Standard curve of prodigiosins

2.2 发酵参数优化

2.2.1 发酵培养基优化 在单因素实验的基础上,对影响灵菌红素产量的蔗糖、蛋白胨、氯化钙为主要因素进行正交实验,测定发酵液中灵菌红素的含量,其结果与方差分析见表3、表4。

从表3可以看出,2号实验组合,灵菌红素的含量最高,由极差分析可知,在发酵培养基中影响灵菌红素含量的因素主次顺序为:B>C>A,即蛋白胨影响最大,其次为氯化钙,蔗糖影响最小。研究表明,F值越大,该因素影响越显著,由表4方差分析表明,三因素中蛋白胨对灵菌红素影响显著(p<0.05),其它两种因素影响不显著。综合极差和方差分析,ZY-H菌株产灵菌红素的发酵培养基最优组合为A1B2C2,即蔗糖为10g/L、蛋白胨15g/L、氯化钙为0.025mol/L,在28℃,180r/min恒温培养48h,灵菌红素含量最高,达到21.53 g/L。

2.2.2 发酵条件优化 在培养基固定的条件下,根据单因素实验,对影响灵菌红素的发酵液初始pH、发酵时间、温度、装液量和接种量进行L16(45)正交实验设计,以发酵液中灵菌红素的含量作为衡量指标,实验结果与方差分析见表5、表6。

表3 培养基正交实验及结果Table 3 Data of orthogonal test for culture medium

表4 培养基的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal array for culture medium

由表5极差分析可以看出,各因素对灵菌红素含量影响的主次顺序为时间>温度>接种量>pH>装液量,发酵时间影响最大,温度次之,装液量影响最小。从表6方差分析可以看出,4因素均不显著(p>0.05);从F值的大小看出,发酵时间、发酵温度、接种量影响较大,pH影响较小。综合分析,细菌ZY-H产灵菌红素的发酵条件最佳组合为A4B2C2D4E1,即发酵时间48h,温度28℃,pH6,接种量4%,装液量为30mL/250mL。

2.2.3 验证性实验 对优化的发酵参数进行重复5次实验,实验结果表明,在蔗糖为10g/L、蛋白胨为15g/L、氯化钙为0.025mol/L时,调节发酵液pH6,接种量为4%,装液量为30mL/250mL,在温度为28℃,180r/min培养48h时,发酵液中灵菌红素的平均含量为28.37g/L。优化培养基与PDA、牛肉膏蛋白胨培养基在相同条件下进行比较,结果如图2。从图2可以看出,优化后的培养基与PDA和牛肉膏蛋白胨培养基相比较,产灵菌红素分别为28.37、1.45、0.87g/L,优化后培养基是PDA培养基和牛肉膏蛋白胨培养基的19.57、43.11倍,且差异极显著(p<0.01),菌体浓度的变化趋势与灵菌红素的变化相一致。优化后的培养基与PDA和牛肉膏蛋白胨培养基在同一条件下,发酵液的颜色变化较大,PDA和牛肉膏蛋白胨培养基发酵液用酸性乙醇浸提后呈淡红色,优化培养基颜色很深,说明优化培养基和条件有利于细菌ZY-H产生灵菌红素。

表5 发酵条件正交实验及结果Table 5 Data of orthogonal test for fermentation condition

表6 正交设计方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal array for fermentation condition

图2 不同条件下菌体浓度和灵菌红素的比较 Fig.2 Comparison of cell concentration and producing prodigiosin in different conditions

3 结论与讨论

本研究通过正交实验优化法探讨了影响细菌ZY-H产灵菌红素的培养基组分和发酵条件。培养基组分配比和发酵条件的不同可以显著影响代谢物质的产量[16]。目前,关于灵菌红素的研究大多集中在抗癌、免疫抑制等性能上,对于筛选高产菌株及发酵参数的研究也有大量报道,吴欢欢等人[17]在花生粉基本培养基中添加小麦粉和二甲亚砜灵菌红素达到5.8g/L,是目前国内报道的最高水平;李子武等人[18]报道Serratia marcescens JNB5-1菌以蔗糖(20g/L)和牛肉膏(15g/L)分别为碳源和氮源,添加脯氨酸、硫酸镁和硫酸亚铁,灵菌红素的产量达到4.139g/L;Venil,C. K.等人[3]报道Serratia marcescens SWML08菌以磷酸铵作为氮源,乳糖作为碳源,添加微量元素,灵菌红素为1.394g/L;Helvia W 等人[19]采用木薯废液甘露醇培养基发酵液中灵菌红素达到49.5g/L,虽然色素产量很高,但要受到原料的季节性限制;而本研究细菌ZY-H以蔗糖、蛋白胨为碳源和氮源,添加0.025mol/L的氯化钙,发酵液中灵菌红素含量达到21.53g/L,优化培养基与上述文献相比较简单易得,不受原料的限制,可以应用在实际生产中;Robert P. Williams等人[20]研究了温度对Serratia marcescen产灵菌红素的影响,发现温度对灵菌红素的产量有显著影响;牛燕等人[11]研究海洋细菌S-9801产灵菌红素的最佳条件为pH5、温度30℃,发酵时间为48h,此时发酵液中灵菌红素产量达到30mg/L,本研究发现,在发酵液初始pH6,接种量为4%,装液量30mL/250mL(即12%的装液量),在温度为28℃,180r/min培养48h时,灵菌红素的含量达到28.37g/L,分别是PDA培养基和牛肉膏蛋白胨培养基的19.57,43.11倍。通过以上比较分析,ZY-H菌产灵菌红素的培养基成分简单,发酵周期较短,灵菌红素的产量高,适宜产业化生产。

本研究对分离到的一株细菌ZY-H产灵菌红素的发酵参数进行了优化,为该菌的工业化生产提供了一定的参考,但是要应用在实际生产中,后续要对放大参数进行优化;菌株进行分子鉴定以确定其归属;并采用诱变、分子生物学等技术进行改造以进一步提高灵菌红素的表达量。

[1]Sung jin kim,Hong kum lee,Yoo kyung lee,etal. Mutant selection of hahella chejuensis KCTC 2396 and statistical optimization of medium components for prodigiosin yield-up[J]. Journal of microbiology,2008,46(2):183-188.

[2]李洪波,杜巍,赵凯,等. 灵菌红素研究进展[J]. 生物技术通讯,2011,22(1):139-142.

[3]Venil C K,Lakshmanaperumalsamy P. Application of statistical design to the optimization of culture medium for prodigiosin production by Serratia marcescens SWML08[J]. Malaysian Journal of Microbiology,2009,5(1)：55-61.

[4]刘同军,杨海龙,唐华. 灵菌红素的研究进展[J].食品与药品,2007,9(8a):47-51.

[5]朱雄伟,翟莉莉,张楠,等. 产灵菌红素菌株的分离鉴定[J]. 河北大学学报：自然科学版,2012,34(4):384-386,393.

[6]王玉洁,孙诗清,朱长俊,等.天然红色素灵菌红素的抗菌性能及应用[J]. 天然产物研究与开发,2012,24(11):1626-1629,1654.

[7]刘伯雅,魏东芝,鲁思然,等.灵菌红素对有害藻类的除藻活性研究[J]. 中国环境科学,2010,30(4):477-482.

[8]王以斌,何碧娟,郑洲,等. 红树林细菌Flavobacterium sp.的抑藻活性鉴定及其对亚历山大藻抑制作用的初步研究[J].中国海洋药物杂志,2008,27(6):1-4.

[9]Giri A V,Anandkumar N,Muthukumaran G,etal. A novel medium for the enhanced cell growth and production of prodigiosin from Serratia marcescens isolated from soil[J]. Bio Med CentraL Microbiol,2004,99(6):616-622.

[10]Sole Montserrat,Rius Niria,Francia Alicia,etal. The effect of pH on prodigiosin production by non-proliferating cell of Serratia marcescens[J]. Letters in Applied Microbiology,1994,19(5):341-344.

[11]牛燕,郑立,田黎,等. 海洋细菌S-9801代谢产灵菌红素最佳培养条件的研究[J]. 中国海洋药物杂志,2009,28(3):17-22.

[12]郝名慧,楼志华,张梁,等. 一株粘质沙雷氏菌发酵产红色素及其结构的研究[J]. 天然产物研究与开发,2007,19(3):439-422.

[13]刘晓侠,沈振中,胡星夏,等.一株红色素高产菌的鉴定、发酵及结构表征[J].药物生物技术,2010,17(3):212-216.

[14]李彩霞,焦扬,高海宁,等. 一株细菌红色素的结构及理化性质[J]. 食品科学,2011,32(7):156-161.

[15]杨汝德,吴虹,林晓珊. 现代工业微生物学实验技术[M].北京:科学出版社,2009,254-256.

[16]辛媛媛,侯美玲,郝志敏,等. 一株拮抗细菌HJ5高产抗菌物质发酵条件优化[J]. 河北农业大学学报,2012,35(4):70-74.

[17]吴欢欢,孙诗清,王玉洁,等. 灵菌红素发酵工艺的初步优化[J]. 嘉信学院学报,2012,24(6):66-69.

[18]李子武,张显,徐美娟,等. 一株产灵菌红素粘质沙雷氏菌的筛选、鉴定及发酵条件[J]. 食品与生物技术学报,2012,31(10):109-113.

[19]Helvia W,Casullo de Araújo,Fukushima K,etal. Prodigiosin production by Serratia marcesens UCP1549 using renewable resources as a low cost substrate[J]. Molecules,2010,15(10):6931-6940.

[20]Williams R P,Gott C,Qadri SM H,et al. Influence of temperature of incubation and type of growth medium on Pigmentation in Serratia marcescens[J]. Journal of Bacteriology,106(2):438-443.