金黄色葡萄球菌活的非可培养状态的 诱导和复苏

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(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

1982年,徐怀恕等通过对霍乱弧菌和大肠杆菌存活规律的观察,首次提出细菌“活的非可培养状态(viable but non-culturable state,VBNC)”的存在[1]。微生物的VBNC状态近年来受到了学者们的广泛关注。至2010年,70多种细菌被发现能进入这种状态[2]。VBNC状态是细菌的一种特殊存活形式,是指细菌处于不良环境条件下,细胞缩小成球形,用常规方法培养不能生长繁殖,但仍然具有代谢活性的一种特殊生理状态[3]。进入VBNC状态的细菌存在潜在的致病性,不但具有与正常细胞类似的抗原成分、毒力因子,还保留了较低的代谢活性[4],且经过适宜条件下复苏后,可以重新获得感染能力,对人类以及周围环境造成严重威胁[5]。

不同细菌甚至同一细菌的不同菌株进入VBNC状态的条件以及复苏条件都不尽相同。温度、射线、盐度或渗透压、寡营养、干燥、pH的剧烈变化等可能引起细菌一系列的生理变化,进入VBNC状态。而大多数报道中,VBNC菌的复苏方法主要有:逐步升温法、与宿主共同培养法、化学物质添加法、富营养培养法等。

金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)是一种常见的病原菌,可引起严重感染。其广泛分布于自然界,因此食品受污染的机会很多,常见于奶、肉、蛋、鱼及其制品,另外,剩饭、油煎蛋、凉粉引起的中毒事件也有报道。美国疾病预防控制中心报告,由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位,仅次于大肠杆菌。

食源性致病菌是造成食品安全问题的首要因素。然而,目前细菌检测基本是利用传统的培养方法,此方法因无法检测出VBNC菌而易造成漏检现象。因此,VBNC状态的发现不仅让人们对微生物应对不良环境的生理变化有了新的认识,同时也为流行病学、食品安全、水质监测、食品卫生检验等许多方面的研究做出了重大贡献[6]。本文采用低温和食品防腐剂山梨酸钾等条件诱导金黄色葡萄球菌进入VBNC状态,对其复苏条件进行研究,为金黄色葡萄球菌VBNC状态的研究提供了理论依据,对加强食品安全的检测和控制亦具有积极的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

琼脂粉、蛋白胨 北京奥博生物技术有限责任有限公司;牛肉膏、酵母浸出汁、NaCl 国药集团化学试剂有限公司;吐温20、吐温80、山梨酸钾 东盛生物有限公司;脑心浸液培养基(BHI) 广州环凯微生物科技有限公司;API STAPH生化鉴定试剂盒 法国生物梅里埃公司;金黄色葡萄球菌标准菌株 编号26003,中国医学细菌保藏管理中心,在4℃条件下保存于7.5% NaCl的牛肉膏蛋白胨斜面上,并接种于斜面中于37℃培养活化。

150A恒温培养箱 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;Forma Class A2生物安全柜 Thermo公司;扫描电镜 德国TVIPS公司;5417R高速冷冻离心机 德国Eppendorf股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌的诱导 根据实验菌株的适宜培养条件,选择对细菌生长不利条件作为诱导VBNC状态的候选因素。在考虑温度、pH、养分、盐度、山梨酸钾浓度的基础上,确定诱导条件。在单因素实验的基础上,进一步采用混合均匀设计诱导方案,选定对金黄色葡萄球菌进入 VBNC状态具有重要影响的3个因素,其中温度和山梨酸钾的浓度各取3个水平,营养条件为2个水平,富营养(含7.5% NaCl的肉汤)记为1,寡营养(含7.5% NaCl溶液)记为0,实验因素及水平见表 1。

诱导过程中每隔2d取样,用平板计数记录菌数的变化,当可培养细菌数降到0时,再连续测定3d可培养细菌数仍然为0时,即初步认为实验细菌进入VBNC状态。以诱导天数为评价指标,对诱导方案进行评价。

表1 实验因素水平U6(32×21)Table 1 Experiment factors U6(32×21)

1.2.2 VBNC状态金黄色葡萄球菌的复苏 分别采用直接升温法(升温至37℃)、添加液体培养基升温法(含0.5%、7.5% NaCl的肉汤,BHI液体培养基)、添加不同浓度酵母液(0.025%、0.05%、0.1%)的培养基升温法、添加不同浓度吐温20或吐温80(0.25%、0.5%、1%)的培养基升温法对VBNC状态的金黄色葡萄球菌进行复苏。每隔24h取合适稀释度的菌液100μL涂布营养琼脂平板,于37℃培养,观察是否有菌落长出。绘制VBNC状态金黄色葡萄球菌复苏生长曲线。

1.2.3 金黄色葡萄球菌的形态观察 将正常状态以及复苏后的金黄色葡萄球菌划线于平板上,进行菌落形态观察,并对菌体进行革兰氏染色观察和扫描电镜观察,描述细菌个体形态特征。

1.2.4 复苏后金黄色葡萄球菌的生理生化特性 对复苏的金黄色葡萄球菌进行生理生化特性分析,采用法国生物梅里埃公司的API STAPH试剂条进行。根据说明书判断反应,参照分析图索引和鉴定软件可以得出鉴定的结果。

1.2.5 数据处理方法 利用DPS7.05软件数据处理系统对实验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌VBNC状态的诱导

2.1.1 不同pH和低温条件下金黄色葡萄球菌的存活 由图1可以看到,低温环境中,6种pH条件下的金黄色葡萄球菌随着处理时间的增加,其数量都呈下降趋势。其中pH3.8和pH4.4的曲线下降最快,经过近3个月的处理后,细菌的存活数量已经接近于0,这意味着有可能进入VBNC状态。而其他pH下,菌数下降到一定程度后,仍有一定的活菌。

图1 金黄色葡萄球菌在不同pH条件下4℃中的存活曲线 Fig.1 Survival curves of S. aureus under 4℃ at different pH

2.1.2 金黄色葡萄球菌在山梨酸钾溶液中的存活 图2显示金黄色葡萄球菌在山梨酸钾溶液中经过一定时间的诱导,可培养菌的总数不断减少。从第16d开始,4℃下的金黄色葡萄球菌存活菌数由原来最初的2.10×109CFU/mL下降至0,经过再次平板涂布实验后,确定已无存活菌,说明其可能进入VBNC状态。而37℃条件下至16d的金黄色葡萄球菌存活菌数仍维持在2.60×104CFU/mL,未能进入VBNC状态。

图2 金黄色葡萄球菌在山梨酸钾溶液中的存活曲线 Fig.2 Survival curves of S. aureus in potassium sorbate solutions

2.1.3 不同盐度下金黄色葡萄球菌的存活 从图3可知,在诱导的过程中,金黄色葡萄球菌具有一定的耐盐性,在诱导初始,均受到一定的抑制,但在耐盐范围内的金黄色葡萄球菌随后开始适应环境,而高盐度(20%)下金黄色葡萄球菌受到了明显抑制,但都未能进入VBNC状态。

图3 金黄色葡萄球菌在不同盐度下的存活曲线 Fig.3 Survival curves of S. aureus under different salinity

2.1.4 混合均匀设计诱导方案下金黄色葡萄球菌的存活 随着诱导时间的延长,金黄色葡萄球菌可培养数不断减少,下降最慢的是10mmol/L山梨酸钾富营养状态37℃的诱导方案(诱导方案1),当至132d时,可培养菌总数下降为0;而0.5mmol/L山梨酸钾、寡营养状态、-20℃条件下(诱导方案6),诱导时间最短,为76d;另外4种诱导方案下分别于84、84、85、85d进入VBNC状态,结果如图4。不同诱导条件下的诱导天数见表2。

图4 不同诱导条件下金黄色葡萄球菌的存活曲线 Fig.4 Survival curves of S. aureus under different induce conditions

利用DPS7.05软件数据处理系统对表2所示实验结果进行二次多项式逐步回归分析,得回归方程:

Y=80.7645460+0.14842831047X2+2.9719679350X1×X3+0.4339634295X2×X3

表2 不同诱导条件下的诱导天数Table 2 The induce period of different induce conditions

2.2 VBNC状态金黄色葡萄球菌的复苏

2.2.1 直接升温复苏法 经每隔24h取样37℃培养观察,发现直至14d后仍未发现有菌落生长。因此,推测单纯采用升温复苏的方法不能使VBNC状态的金黄色葡萄球菌复苏。

2.2.2 添加液体培养基升温复苏法 经每隔24h取样37℃培养计数,发现采用肉汤培养基升温的方法不能使菌体复苏,直至14d后仍未见有菌落长出。而采用BHI液体培养基升温复苏法培养2d时,取样涂布营养琼脂平板可见有大小一致的金黄色葡萄球菌单一菌落,菌数为102CFU/mL。随着复苏时间的延长,可培养细菌数迅速增加,至 5d时,可培养菌数约为107CFU/mL。表明BHI液体培养基复苏法可使VBNC状态的金黄色葡萄球菌复苏。

2.2.3 添加酵母液升温复苏法 经每隔24h取样37℃培养观察,发现14d后仍未有菌落生长。因此推测添加酵母液升温的方法不能使VBNC状态的金黄色葡萄球菌复苏。

2.2.4 添加吐温升温复苏法 经每隔24h取样37℃培养观察,发现采用0.25%的吐温20或吐温80培养液升温的方法不能使菌体复苏,而采用0.5%及1%的吐温20或吐温80培养液升温复苏法培养2d时,可培养菌落数达到1.0×102CFU/mL,随着复苏时间的延长,可培养细菌数迅速增加,至5d时,可培养菌数最多达到1.0×108CFU/mL。吐温20和吐温80的浓度越大,菌落数越多,且相同浓度下吐温80复苏的菌落数略多于吐温20。结果如图5所示。

表3 复苏后及正常状态的金黄色葡萄球菌的生理生化检测结果Table 3 The identification results of the resuscitative and normal cells by API STAPH system

图5 VBNC状态金黄色葡萄球菌在吐温20 及吐温80培养液中的复苏曲线 Fig.5 Resuscitation curves of S. aureus in Tween 20 and Tween-80 solutions

2.3 金黄色葡萄球菌的形态观察

在普通营养琼脂平板上,正常状态的及复苏后的金黄色葡萄球菌菌落厚、表面光滑湿润、圆形凸起、边缘整齐,但正常状态的菌落呈黄色,复苏后的菌落乳白色,而进入VBNC状态的金黄色葡萄球菌无法长出菌落。

取正常状态、VBNC状态及复苏后的金黄色葡萄球菌在扫描电镜下进行观察,发现正常状态及复苏后的金黄色葡萄球菌呈圆球状(图6a,图6b),而进入VBNC状态的细胞变成不规则球形,细胞体积变小,且菌体分散(图6c)。

图6 扫描电镜下不同状态的 金黄色葡萄球菌的形态特征(×10000) Fig.6 Morphological characteristics of different states of S. aureus

2.4 复苏后的金黄色葡萄球菌的生理生化特性

以法国生物梅里埃公司的API STAPH生化鉴定试剂盒对复苏的金黄色葡萄球菌进行生化鉴定,按照API STAPH生化反应表对反应的结果进行判读和记录,结果见表3。将鉴定结果输入软件,得出复苏菌株的鉴定百分比为98.1%。复苏后的菌株除尿素酶阴性外,其他代谢特征均与标准菌株相同,因此可推断VBNC状态的金黄色葡萄球菌经过复苏基本恢复了正常的代谢过程。

3 结论与讨论

3.1 金黄色葡萄球菌VBNC状态的诱导

诱导细菌进入VBNC状态的条件较多,其中,低温、高温、寡营养、重金属、光照等是主要的影响因素[7]。本研究采用了不同pH、温度、不同浓度山梨酸钾以及不同盐度处理等方法对金黄色葡萄球菌进行诱导,结果发现低温对诱导影响最大,且温度越低诱导天数越短,山梨酸钾浓度与营养条件对金黄色葡萄球菌的诱导起协同作用。而单一的条件处理,如盐度,在本实验中未能成功诱导金黄色葡萄球菌进入VBNC状态。说明金黄色葡萄球菌对不良环境的适应性较强,需更为不利的环境才有可能诱导其进入状态。

3.2 VBNC状态金黄色葡萄球菌的复苏

本研究对菌株的复苏采用了直接升温复苏法、添加液体培养基升温复苏法、添加酵母液升温复苏法及添加吐温的升温复苏法。最后实现复苏的是采用BHI培养基升温的方法,以及添加0. 5%和1%的吐温20或吐温80的培养液升温方法,由复苏曲线显示,5d后所有复苏的金黄色葡萄球菌均达到了1.0×106的数量级以上,且相同浓度下吐温80培养液的复苏能力优于吐温20。

复苏看似简单的诱导逆过程,即将诱导因素去除,复苏就可以实现。然而事实上,复苏是一个极其复杂的过程,同种复苏方法对于不同细菌乃至同一细菌的不同菌株的影响都不尽相同。Jiang等[8]发现进入VBNC状态的副溶血弧菌在温度由3.5℃升高到室温后,3d内就可从活的非可培养状态恢复为可培养状态。而鲁梅芳等[9]研究指出,逐步升温法对于VBNC状态的金黄色葡萄球菌没有任何作用。本实验采用直接升温复苏法、添加肉汤培养基升温复苏法、添加酵母液升温复苏法均没有使VBNC状态的金黄色葡萄球菌复苏成功,而采用BHI培养基升温方法,以及添加0.5%、1%的吐温20及吐温80培养液升温的方法,细菌恢复为可培养状态。Bloomfield等[10]研究推测,由于营养缺乏而进入VBNC状态的微生物,其营养机制与转运途径之间亲和力有了极大的提高,当重新接种到营养丰富的培养基上时,由于过量营养物质的摄入,基质会迅速氧化导致过多的自由基和超氧化物的产生,从而损害了细胞甚至导致其死亡。因此,实验中的营养物质,如肉汤和酵母液,可能会导致产生过多损害细胞的自由基和超氧化物,使其无法复苏。而吐温20及吐温80为非离子表面活性剂,可降低表面张力,从而增大细菌的活性,且其可为VBNC状态的金黄色葡萄球菌提供充分的碳源,使细菌恢复可培养状态[11]。本研究中,相同浓度下吐温80培养液的复苏能力优于吐温20,可能是由于吐温80的乳化性较强,可作为增溶剂,从而增强了复苏的效果。

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