原生质诱变选育高产酸性 α-淀粉酶黑曲霉菌株

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(长沙理工大学食品与生物工程系,湖南长沙 410114)

酸性α-淀粉酶是指能在低酸性条件下水解淀粉的α-淀粉酶[1]。目前,市场上常用的中温和高温α-淀粉酶均属中性α-淀粉酶(最适pH6.0～7.0),在酸性条件下酶活降低,不能满足酸性条件下淀粉原料深加工工艺的要求;酸性α-淀粉酶的最适pH 为2.0～5.5,其对酸的稳定性明显高于中温α-淀粉酶,能在低pH下液化淀粉,可免去淀粉原料加工过程中反复调酸的环节[2]。因此,开发耐酸性α-淀粉酶具有很大的经济、社会和环境效益,当其在食品加工等行业应用后,不仅可以革新淀粉加工生产工艺,降低生产成本,提高产品质量,还能大大节约工业用粮以及水、电等宝贵资源。

自1963年日本研究者Yasuji Minoda等[3]用黑曲霉(Asperillusniger)生产耐酸性α-淀粉酶以来,各国都对耐酸性α-淀粉酶进行了研究。目前,丹麦、美国、日本等国家已有耐酸性α-淀粉酶的发酵产品,但价格昂贵难以满足市场的需要。我国开展相关研究起步较晚,20世纪90年代时,中科院微生物研究所的科研人员研究了嗜热真菌Thermomyoeslanuginosus产耐酸性α-淀粉酶的特性[4]。此后,江南大学、四川大学、南京大学等多所院校及研究所相继开展了相关研究,主要集中在产耐酸性α-淀粉酶生产菌株的选育、发酵条件优化和基因工程菌构建等方面。然而,无论工程菌或从自然界筛选的菌株,均存在酶活力低、热稳定性差以及生产成本较高的问题,故至今国内仍未实现其工业化生产。

原生质体诱变技术是工业微生物育种的主要技术,相比常规诱变育种技术具有操作简单、诱变效果好等优点[4-5]。目前,以原生质体诱变技术选育高产酸性α-淀粉酶黑曲霉菌株的研究报告较少,本文通过对黑曲霉的原生质体进行紫外诱变选育,获得产酸性α-淀粉酶较高的优良菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 出发菌株 实验室筛选、保存的黑曲霉菌株,编号为0-2-1。

1.1.2 培养基 斜面培养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基加水,灭菌后调节pH4.5。

高渗培养基:蛋白胨0.5g,葡萄糖1.5g,MgSO4·7H2O 0.05g,MnSO4·7H2O 0.003g,FeSO4.7H2O 0.003g,琼脂粉2g,加入100mL 0.6mol/L NaCl溶液作为溶剂,灭菌后调节pH4.5。

低渗培养基:蛋白胨0.5g,葡萄糖1.5g,MgSO4.7H2O 0.05g,MnSO4.7H2O 0.003g,FeSO4.7H2O 0.003g,琼脂粉2g,以100mL蒸馏水作溶剂,灭菌后调节pH4.5。

筛选培养基:蛋白胨0.5g,可溶性淀粉2g,MgSO4.7H2O 0.05g,MnSO4.7H2O 0.003g,FeSO4.7H2O 0.003g,琼脂粉2g,以100mL蒸馏水作溶剂,灭菌后调节pH4.5。

复筛(液体)培养基:蛋白胨0.5g,酵母膏0.5g,2g可溶性淀粉,MgSO4.7H2O 0.05g,MnSO4.7H2O 0.003g,FeSO4.7H2O 0.003g,以100mL蒸馏水作溶剂,灭菌后调节pH4.5。

蜗牛酶、溶菌酶,生化试剂,购自上海博奥生物科技有限公司;纤维素酶,生化试剂,购自国药集团化学试剂有限公司。

LG10-2.4 高速离心机 北京京力离心机有限公司;LRH-250生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;SW-CJ-2F双人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司;MP-160B霉菌培养箱 上海福玛实验设备有限公司;UV-2100紫外分光光度计 上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酸性α-淀粉酶活力的测定 参考文献[5]方法稍作修改,在10mL试管中加入1mL 1%的可溶性淀粉溶液,并加入3.5mL的pH4.5的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液,40℃预热10min。加入0.5mL发酵液,精确保温10min。取1mL加入到4mL 0.1mol/L的HCl中终止反应,并取1mL反应液与9mL 0.5%碘液显色,测定OD660。

酶活定义:一个酸性α-淀粉酶单位相当于在pH4.5,温度40℃的条件下,1min将1mL浓度为1%的可溶性淀粉的显蓝强度降低1%所需的酶量[6-7]。

式中:D0为空白吸光值;D为主吸光值;100为系数;10为反应时间(min)

1.2.2 原生质体的制备和再生 参考文献[8-10],将活化好的菌种接种于PDA斜面培养基上,于28℃恒温培养72h,用无菌水从斜面洗脱孢子至有玻璃珠的三角瓶,振荡使孢子分散,4层纱布过滤。离心(8000r/min,10min)收集孢子,用含有0.1% β-巯基乙醇和0.01mol/L Na2EDTA的溶液悬浮,室温下振荡10min,离心收集孢子,无菌水洗涤,用0.9mol/L的甘露醇溶液(pH6.8)渗透压稳定剂将孢子浓度调整为8×105cfu/mL,加入终浓度为1%蜗牛酶、1%溶菌酶、1%纤维素酶,选置于30℃水浴酶解时间2h,涂布于低渗和高渗培养基,计算原生质体制备率和再生率。

1.2.3 原生质体紫外诱变 将制备好的原生质体稀释100倍,取5mL,移入直径9cm培养皿内,置于距30W紫外灯30cm处的磁力搅拌器上照射[11],每30s取菌液用渗透压稳定剂稀释后涂布平板,28℃避光培养72h。

1.2.4 初筛 固体平板透明圈法:挑选生长较好的菌落,用灭过菌的牙签分别点接至初筛培养基,依次编号,28℃培养,测量透明圈与菌落直径比(HC值),以出发菌株的为对照[12]。

1.2.5 复筛 挑选HC值较出发菌株明显大的8株菌接种在斜面培养基上,培养48h,接种到发酵培养基中,28℃摇瓶培养72h,将发酵液离心(8000r/min,15min),取上清液测定酸性α-淀粉酶酶活。

1.2.6 遗传稳定性测试 选取复筛所得到的酶活较高的突变株进行连续传代,每次传代后发酵培养,测定酸性α-淀粉酶酶活。

1.2.7 数据统计分析 每组实验进行3～5个平行,以其平均值±标准差报道,平均值和标准差以Microsoft Excel软件计算。

2 结果与分析

2.1 原生质体的制备与再生

通过对原生质体制备条件的优化[11-13],出发菌株原生质体形成率为77.4%,再生率为44.2%。黑曲霉孢子及其原生质体显微形态如图1所示,可见原生质体和孢子均为圆形,原生质体形态比孢子稍大,显微镜下颜色较浅。

图1 黑曲霉孢子和原生质体照片 Fig.1 Spores and protoplast photos of Aspergillus niger

2.2 原生质体诱变

以制备好的原生质体液进行紫外线诱变,每间隔30s取样涂布,结果如图2所示。可见,紫外线照射时间为180s时,致死率达到了83.3% 。根据微生物诱变育种的规律,一般认为致死率在80%以上,诱变的效果比较好[15],但也有报道指出,致死率在70%～80%之间正向突变的诱变菌株出现的机会较多[17],但较低的致死率大大增加了筛选的工作量,因此选择180s的紫外线照射剂量。

表1 原生质体紫外诱变筛选结果Table 1 Protoplast Mutation Strains of HC ratio

表2 复筛菌株遗传稳定性实验Table 2 Rescreening strain genetic stability test

图2 紫外照射时间对原生质体致死率的影响 Fig.2 Effect of UV irradiation time on fatal rate of protoplast

2.3 优良菌株筛选

从再生菌株中选出56株透明圈明显的突变株测量其HC值,得到8株HC值明显提高的突变株,其中UV9与出发菌株透明圈的比较如图3所示;对8株初筛的突变株摇瓶培养,测定发酵液中粗酶的酶活进行复筛,结果如表1所示。可见,正突变株的HC值与其发酵液中酸性α-淀粉酶酶活并非严格的正相关,这可能与其生长速度不一致有关,但趋势大体上一致。综合初筛、复筛结果,突变株UV9、UV17、UV31性能相对较优,其酶活相对出发菌分别提高了54.9%、38.1%、42.0%,需进一步检验其遗传稳定性。

图3 突变株UV9与出发菌株透明圈比较 Fig.3 Transparent circle comparison of the original strains and mutant strains UV9

2.4 遗传稳定性测试

将突变株UV9、UV17、UV31连续传代10次,测定其产酶能力的稳定性,结果如表2所示。以相对于未传代的突变株的酶活变化率为指标,一般认为变化率保持在±5%以内的菌株就具有较好的遗传稳定性[3,15]。可见,复筛所得3株突变株均具有较好遗传稳定性,能保持相对稳定的较高酸性α-淀粉酶活力。

3 结论

以产酸性α-淀粉酶的黑曲霉0-2-1为出发菌,制备其孢子原生质体,选用紫外线照射180s作为诱变剂量进行紫外诱变,最终筛选得到3株酶活有较大提高的突变株UV9、UV17、UV31,其酸性α-淀粉酶活力为184.66、162.73、167.31U/mL,分别比出发菌株提高了54.9%、38.1%和42.0%,遗传稳定性实验证明3株突变株传代过程中均保持相对稳定的较高酸性α-淀粉酶活力。实验结果表明原生质体诱变是选育耐酸ɑ-淀粉酶高产菌株行之有效的方法。

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