气体二氧化氯对小麦表面细菌杀灭效果研究及菌种鉴定

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(中北大学化工与环境学院,山西太原 030051)

小麦在生产运输贮藏过程中表面易染菌,染菌小麦不同程度地存在着质量和安全隐患[1]。为防止小麦在加工前表面染菌,增加其安全性,国内外以多菌灵[2]、红外线[3-4]、紫外线、臭氧、福美双和三唑酮等为主[5]对小麦的表面进行杀菌。这些方式都对小麦表面的微生物具有一定的杀灭作用,但是它们杀菌效率低、杀菌不彻底、杀菌剂有残留,且存在不易实现大面积杀菌的缺点。作为目前国际上公认的新一代广谱、高效、安全的绿色杀菌剂[6],二氧化氯几乎对所有细菌、霉菌、真菌、病毒都有杀灭作用[7],且杀菌后无残留,已经被应用于食品[8-9]和公共场所[10]等方面的杀菌消毒,但直接用于对小麦表面的杀菌报道较为少见。本文以气体二氧化氯作为杀菌剂,研究了不同条件下其对小麦表面细菌的杀灭效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦 山西省粮油科学研究所提供;亚氯酸钠 天津市光复精细化工研究所;氯化钠 天津市申泰化学试剂有限公司;无水乙醇 天津市德恩化学试剂有限公司;氢氧化钠 南京化学试剂有限公司;牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉 北京奥博星技术有限公司;浓盐酸 太原化肥厂化学试剂厂。

ESJ200-4型电子分析天平 沈阳龙腾电子有限公司;BJ-2CD型净化工作台、YXQ-LS-18S1型自动手提式灭菌器、SPX-250B-Z型生化培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;JB-3型定时恒温磁力搅拌器 上海雷滋新泾仪器有限公司;WDYV1-1000型微量移液器 上海求精生化试剂仪器有限公司;TYJ-2A型菌落计数器 上海华光仪器仪表有限公司;ZDHW型电热套 北京中兴伟业仪器有限公司;UV-9600紫外/可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司;BCD-202K利莱克斯家用电冰箱 伊莱克斯(中国)电器有限公司;自制灭菌柜 约334L。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 称量:称取牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g加入1000mL烧杯中;溶解:在该烧杯中加水至800mL左右,用玻璃棒搅拌均匀,电热套加热使其全部溶解;调节pH至7;定容:将调好pH的培养基加水定容至1000mL;分装:将配制好的培养基分装入三角烧瓶中;加凝固剂:称取一定量(约培养基量的25%)的琼脂粉加入分装有培养基的三角瓶中;灭菌:包扎后,在121.3℃和高压下将培养基灭菌20min;倾注平皿:将灭菌后的培养基在凝固之前倒入灭过菌的培养皿中,约15～20mL。

1.2.2 实验用品灭菌 称取4.25g NaCl配制500mL生理盐水,之后将其分装成每份225mL于三角瓶中,加塞包扎高压蒸汽灭菌(0.075MPa,15min);涂布器、枪头、500mL空三角瓶、培养皿,高压蒸汽灭菌(0.1MPa,25min)。

1.2.3 小麦灭菌 将称取好的小麦样品平铺在灭菌柜内,密封后,使二氧化氯气体产生,气体二氧化氯对小麦的杀菌浓度梯度分别为1、2、4、6、8、10mg/L,灭菌时间为3h,灭菌完成后打开灭菌柜取样检测样品上剩余的细菌总量。

1.2.4 接种及菌落计数

1.2.4.1 接种及培养 称取杀菌前后样品,根据GB/T4789.2-2008食品卫生微生物学检验菌落总数测定[11]的实验步骤,采用10倍递增稀释法稀释菌悬液,分别进行平板涂布,在37℃恒温培养箱中培养48h。

1.2.4.2 菌落计数 用菌落计数器进行计数,杀菌前后微生物总量的测定方法相同,微生物总数测定采取标准平板菌落计数法[11],杀菌率按照如下公式进行计算。

式(1)

式中,N1表示杀菌前平均菌落数;N2表示杀菌后平均菌落数。

1.2.5 染色实验 采用平板分离法[12]从染菌的小麦计数平板上长出的菌落中分别挑取培养基中菌落数最多(具有代表性)的2种微生物,标记为X1、X2,对这2种微生物分别进行革兰氏染色实验和芽孢染色实验。

1.2.5.1 革兰氏染色 制片:取活跃生长期菌种按常规方法涂片、干燥和固定。

染色:初染:滴加草酸结晶紫染液覆盖涂菌部位,染色2min,水洗至流出水无色;媒染:用卢戈氏染液冲去残留水迹,再用碘液覆盖1min,倾去碘液,水洗至流出水无色。脱色:将玻片上的水用吸水纸吸取,用滴管滴加95%乙醇脱色(持续20s),稍后立即洗去乙醇。复染:将玻片上的水用吸水纸吸去,用番红复染液染色2min,水洗,吸去残水烤干。

镜检:分别用香柏油覆盖涂菌部位,先用低倍镜找到菌,换用100倍的物镜观察染色情况。观察结束后,用二甲苯擦洗镜头。

1.2.5.2 芽孢染色 制片:按常规涂片、干燥、固定。

染色:加数滴5%孔雀绿染液于涂片上,用木夹夹住载玻片一端,在微火上加热至染料冒蒸汽并开始计时。维持5min。加热过程中及时补充染液，切勿让涂片干涸。

水洗:待玻片冷却后,用缓流自来水冲洗载玻片背面,直至流出的水无色为止。

复染:用0.5%番红染液复染1.5min。

水洗:用缓流水洗后,干燥。

镜检:先低倍镜,再高倍镜,最后油镜观察。

1.3 实验流程图

图1 实验流程图 Fig.1 Flow diagram of experiment

2 结果与分析

2.1 小麦杀菌前后微生物总量计数结果及分析

按照1.2.4所述的计数方法,不同浓度下,杀菌时间为3h,杀菌前后小麦表面菌落数及杀菌率如下表所示:

表1 杀菌前后菌落数及杀菌率Table 1 Colony count before and after sterilization and sterilization rate

从表1中可以看出,杀菌时间为3h的条件下,随着二氧化氯气体浓度的增大,杀菌率逐渐上升,小于2mg/L时杀菌率随浓度变化的影响较大,在二氧化氯浓度为8mg/L时的杀菌率达到99.90%,到10mg/L时杀菌率为99.91%,无明显增加趋势。这是因为在气体二氧化氯浓度较低时,能杀死小麦表面大部分的细菌,杀菌率的增加趋势较为明显;当浓度增大到一定程度以后,绝大部分的细菌被杀死,还有部分抗性较强的细菌,较难杀灭;二氧化氯气体随着时间的延长,气体部分被分解[13],浓度下降,因此,在较低浓度时,杀菌率随气体二氧化氯浓度的变化较大,在一定时间内,杀菌率达到一定程度后,随着浓度的继续增加,杀菌率基本保持不变,在杀菌时间为3h时,二氧化氯杀菌浓度8mg/L为宜。

2.2 同一浓度下不同杀菌时间对杀菌率的影响

气体二氧化氯为8mg/L时,为了确定合适的杀菌时间,以杀菌率为主要指标,考察在不同时间条件下,对杀菌率的影响,实验结果如图2。

图2 杀菌时间对杀菌率的影响 Fig.2 The influence of the different sterilization time on sterilization rate

从图2可知,在60min内,杀菌率随着杀菌时间的增加明显增加,杀菌时间达到90min时,杀菌率为99.85%,继续延长杀菌时间,杀菌率基本保持不变,这是因为在一定时间之内气体二氧化氯的浓度较大,杀菌率有较明显的增长趋势;随着时间的延长,大部分菌落基本被杀灭,杀菌率基本保持不变,因此在二氧化氯浓度为8mg/L时的杀菌时间90min为宜。

2.3 实验结果验证

为了进一步验证实验结果的准确性,按照气体二氧化氯浓度为8mg/L,杀菌时间为90min的条件进行3次重复实验,实验结果如表2。

表2 最佳条件下杀菌率Table 2 The sterilization rate under the best condition

图3为气体二氧化氯浓度为8mg/L,杀菌时间为90min,小麦样品杀菌效果照片。

图3 小麦样品杀菌前后10-1稀释液的平板计数图 Fig.3 The figure of plate count of wheat sample 10-1 diluent before and after sterilization

从图3中可以明显看到杀菌前后微生物数量变化情况,小麦样品的二氧化氯气体杀菌浓度为8mg/L,杀菌时间为90min,杀菌前10-1稀释液的一个平板微生物量较多,杀菌后几乎没有菌落生长,由此可见,在此条件下具有较佳的杀菌效果,在小麦防霉处理中,杀菌的条件为气体二氧化氯浓度8mg/L,杀菌时间90min,能得出较佳的杀菌效果。

2.4 不同含水率小麦杀菌效果比较

含水率是小麦加工过程以及产品品质的重要因素,适宜加工的小麦含水率为13%～17%[14]。气体二氧化氯浓度为8mg/L,杀菌时间为90min时,小麦含水率为8%、13%、15%、17%和20%的杀菌率如图4所示:

图4 不同含水率小麦杀菌效果比较 Fig.4 Comparative sterilization effect of wheat with the different moisture content

从图4中可以看出,随着小麦含水率的增加,杀菌率逐渐下降,在17%以内时,杀菌率都在99%以上,下降幅度较小,当小麦含水率继续增加时,杀菌率有较大幅度的减小,因此,在气体二氧化氯浓度和杀菌时间适当的条件下,二氧化氯对小麦表面的杀菌率会随着含水率的增加逐渐下降。

2.5 菌种鉴定

2.5.1 菌种提取 采用平板分离法从未杀菌小麦样品培养基上长出的菌落中分别挑取具有代表性的2种细菌,标记为X1、X2,菌落图片如图5所示:

图5 未杀菌小麦样品培养基中分离的两种细菌 Fig.5 Two kinds of bacteria seperated on medium of wheat samples without sterilization

2.5.2 革兰氏染色实验结果与分析 革兰氏染色反应[15]是细菌重要的鉴别特征,革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性,菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌,菌体被染成红色的是革兰氏阴性菌。

X1号微生物的革兰氏染色结果如图6所示。

图6 X1革兰氏染色结果 Fig.6 The result of X1 by gram staining

从图中可以看出,菌体被染成蓝紫色,菌体形态近似球菌,说明X1号菌为革兰氏阳性菌。

X2号微生物的革兰氏染色结果如图7所示。

图7 X2革兰氏染色结果 Fig.7 The result of X2 by gram staining

从图7中可看出,菌体被染成红色,菌体形态为杆菌,说明X2号菌为革兰氏阴性菌。

2.3 芽孢染色实验结果与分析

芽孢是芽孢杆菌属和梭菌属生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构,通常为圆形或椭圆形,根据芽孢染色结果判断菌体有无芽孢[16]。

根据油镜观察芽孢是否呈绿色,如图8所示,X1号菌无芽孢;X2号菌无芽孢。

图8 芽孢染色结果 Fig.8 The result of X1(left)and X2(right)spore staining

从图8中的两种菌的染色结果来看,即X1号菌为革兰氏阳性菌,菌体形态为球状,无芽孢;X2号菌为革兰氏阴性菌,菌体形态为杆状,无芽孢。

3 结论

在对小麦表面细菌杀菌过程中,随着气体二氧化氯浓度的增大,杀菌率也增大,一定时间内,二氧化氯浓度成为影响小麦杀菌效果的主要因素,其次是杀菌时间。杀菌时间90min,气体二氧化氯浓度为8mg/L的条件下,对小麦的一次杀菌率达到99.90%,可作为小麦防霉处理的最佳条件。菌落鉴定结果表明,小麦表面的菌落,主要为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,没有芽孢生长。

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