板蓝根及所含靛蓝和靛玉红强烈抑制小鼠肾主要有机阴离子转运体Oat1，Oat2和Oat3

奇锦峰，孙 晨，王永辉，余文浩，韩 坚，林 梅，张 娜

(1.广州中医药大学中药学院药理学教研室，广东广州 510006；2.河南省驻马店市人民医院药剂科，河南驻马店 463000；3.广州市佛山南海中医院西药房，广东广州 528200)

板蓝根及所含靛蓝和靛玉红强烈抑制小鼠肾主要有机阴离子转运体Oat1，Oat2和Oat3

奇锦峰1，孙 晨1，王永辉2，余文浩1，韩 坚1，林 梅3，张 娜1

(1.广州中医药大学中药学院药理学教研室，广东广州 510006；2.河南省驻马店市人民医院药剂科，河南驻马店 463000；3.广州市佛山南海中医院西药房，广东广州 528200)

目的 探讨板蓝根颗粒剂(GRI)和饮片水煎剂(DRI)及其所含主要成分靛蓝和靛玉红对小鼠肾有机阴离子转运体(OAT)中3个主要亚型Oat1,Oat2和Oat3的影响。方法 NIH小鼠分别ig给予GRI 0.615和2.460 g·kg－1,DRI 1.6和6.4 g·kg－1(生药量),靛蓝0.008和0.640 mg·kg－1,靛玉红0.0192和1.5360 mg·kg－1,每组60只(雌雄对半),每天2次,连续5 d。同时设丙磺舒(0.05 g·kg－1)阳性对照组和两种溶媒〔纯水和0.5%羧甲纤维素钠(CMC-Na)水溶液〕对照组及糊精加蔗糖(各1.5 g·kg－1)添加剂组。最后1次给予供试物后实施对-氨基马尿酸(PAH,iv,0.03 g·kg－1)清除实验,即在iv PAH后1.0,2.5,5.0, 7.5,10.0和20.0 min时每组分别各取10只小鼠(雌雄对半),安乐处死收集全血制备血清,并迅速摘取双肾,右肾进行组织匀浆后测定PAH蓄积量,左肾组织用于提取总mRNA。每组另取10只小鼠(雌雄各半),同样给药处理,按Nakakariya法做肾切片进行摄取PAH实验。用Kiguchi法测定血清和肾组织匀浆液中PAH浓度。以药动学软件(DAS 2.0)计算血清及肾组织中PAH的主要药动学参数。以实时定量PCR法测定小鼠肾组织Oat1,Oat2及Oat3 mRNA表达。结果 与纯水对照组比较,0.5%CMC-Na对照组各项检测指标均无显著差异。与两种溶媒对照组相比,GRI 2.460 g·kg－1,靛蓝 0.640 mg·kg－1和靛玉红1.5360 mg·kg－1组消除半衰期(t1/2β)显著延长(P＜0.05)；各供试物组分布容积(Vd)和清除率(Cl)均显著减少(P＜0.01),曲线下面积(AUC0→20min)均显著增加(P＜0.01)；由采血时间段内各组肾组织中的PAH蓄积量所求得的AUC0→20min显著大于同期对照组(P＜0.05,P＜0.01),且肾AUC0→20min与血液AUC0→20min的比值在各组间无显著差异。各剂量供试物均可使肾切片摄取PAH的量显著少于对照组(P＜0.05,P＜0.01)。与纯水/CMC对照组相比,GRI 2.460 g·kg－1,DRI 6.4 g·kg－1,靛蓝0.640 mg·kg－1,靛玉红1.5360 mg·kg－1组小鼠肾组织Oat1,Oat2及Oat3 mRNA表达除靛玉红组Oat2 mRNA(P＜0.05)、GRI组Oat3 mRNA(P＜0.01)表达水平被显著上调外,其余均被显著下调(P＜0.05,P＜0.01)。结论 GRI、DRI、靛蓝、靛玉红在所用剂量下对小鼠肾组织Oat1,Oat2及Oat3均有明显抑制作用,GRI和DRI的这种抑制作用可能主要来自其所含的靛蓝和靛玉红成分。

板蓝根；靛蓝；靛玉红；对-氨基马尿酸；有机阴离子转运体

板蓝根(Radix Isatidis)别名靛青根、蓝靛根或靛根，分为北板蓝根和南板蓝根，是中医清热解毒的常用中药[1]。北板蓝根来源于十字花科植物菘蓝(Isatis tinctoria L.)和草大青(I.indigotica Fort.)的根；南板蓝根为爵床科植物马蓝〔Baphicacanthus cusia(Nees)Brem.〕的根茎和根[1]。板蓝根主要活性成分被认为是靛蓝(indigo)和靛玉红(indirubin)，分别含0.0001～0.0957%和0.0012～0.1118%[2－4]，此外，还含有其他几十种成分[5－6]。近年来有不少大众媒体报道，板蓝根曾引发肾毒性等诸多不良反应[6－9]，然而至今未见有正规的实验研究或临床调查报告证明板蓝根本身或其所含主要化学成分如靛蓝和靛玉红确实能引发肾毒性。

有机阴离子转运体(organic anion transporters，OAT)是溶质转运体(solute carrier，SLC)超家族中 SLC22A基因家族的成员[10]，其主要成员OAT1，OAT2和OAT3多在肾近曲小管上皮细胞基底膜侧表达，介导众多内、外源性有机阴离子型化合物(包括环境毒素、药物及其代谢产物)从细胞外液或血液进入肾小管腔上皮细胞[10－11]，再由其他外排性转运体将它们分泌送入肾小管腔[11]，以便经尿液排出体外，即OAT在哺乳动物排泄体内废弃物及毒物方面具有不可替代的作用[12－13]。

研究发现，OAT一旦被进入体内的化学物质(包括药物、毒物及饮食当中的某些成分)所抑制，将扰乱机体的正常生理活动乃至出现伤害作用[11]，如β-内酰胺类中的头孢曲松、抗病毒药中的阿昔洛韦、抗肿瘤药中的甲氨蝶呤和铂类等的肾毒性均与OAT1和OAT3介导的有机阴离子的摄取功能受阻有关[14－16]，而马兜铃酸所导致的肾毒性机制也约在4年前被证实是抑制OAT1和OAT3的结果[14－15]。

鉴于众多研究表明，化学物质所引发的人类肾损害多与OAT被抑制有关[14－16]，与人类 OAT1，OAT2和 OAT3相对应的同源小鼠Oat分别是Oat1，Oat2和Oat3[17]，故本研究检测了市售板蓝根颗粒(granules of Radix Isatidis，GRI)和自制板蓝根饮片水煎剂(decoction of Radix Isatidis，DRI)以及板蓝根中含量较多的成分靛蓝和靛玉红对小鼠肾组织3个主要Oat亚型Oat1，Oat2和Oat3的转运功能及其基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器

GRI，广州市香雪制药股份有限公司，国药准字Z44020344，批号201301203；DRI，广州市采芝林药业有限公司，经广州中医药大学中药学院黄海波教授鉴定为北板蓝根；靛蓝(纯度98%)、靛玉红(纯度＞95%)和对-氨基马尿酸(para-aminohippuric acid，PAH)(纯度98%)，均为阿拉丁公司；丙磺舒(probenecid)(纯度 98%)，美国 Sigma公司；Tusda试剂(纯度＞98%)，日本东京化成工业株式会社；靛蓝、靛玉红和丙磺舒等均用0.5%羧甲纤维素钠(CMC-Na)溶液充分研磨成细腻的混悬液。蛋白质定量试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术公司；总RNA提取试剂、PrimeScriptTMRT 试剂盒和SYBRⓇPremix Ex TaqTMⅡ，日本TaKaRa公司；特异性引物序列[18](表1)由上海生工生物工程有限公司合成；其他常用试剂均为市售分析纯级。Himac CR22G高速冷冻离心机，日本日立制作所；AsOne数控组织匀浆机，日本 As One公司；WFG7200型紫外可见分光光度计，尤尼柯上海仪器有限责任公司；SmartSpec plus核酸蛋白检测仪，美国Bio-Rad公司；ABI7500型实时荧光定量PCR仪，美国Applied Biosystems公司。

1.2 板蓝根水提物的制备及板蓝根类供试物所含靛蓝和靛玉红的定量

参照《中国药典》2010版中“板蓝根颗粒”的制法[1]，取96 g板蓝根饮片煎煮2次(每次加纯水1 L)，第1次2 h，第2次1 h，滤液合并后浓缩至0.3 L(其生药含量为320 g·L－1)，－20℃冰箱保存备用。DRI和GRI中靛蓝和靛玉红的定量参照文献[19]进行。

1.3 动物、动物分组和给药

12组SPF级NIH小鼠(雌雄对半)，体质量22～30 g(广州中医药大学实验动物中心)，动物合格证号SCXK(粤)2013-0020。饲养条件为室温20～26℃，湿度50%～70%，明暗交替12 h/12 h，随意摄食饮水。动物福利和实验均符合相关实验动物管理条例和实验动物伦理要求。将受试小鼠随机分为12个组，每组60只，纯水对照组，0.5%CMC-Na对照组，糊精加蔗糖添加剂对照组(各1.5 g·kg－1)，丙磺舒阳性对照组(0.05 g·kg－1)，GRI 0.615和2.460 g·kg－1，DRI 1.6和6.4 g·kg－1(生药量)，靛蓝 0.008和0.640 mg·kg－1，靛玉红 0.0192和1.5360 mg·kg－1。各 剂 量 供 试 物 ig 给 予(20 mL·kg－1)，每天2次，连续5 d。

1.4 PAH清除实验[20]

最后1次给予供试物60 min后，所有受试小鼠均尾静脉注射PAH 0.03 g·kg－1，然后在1.0，2.5，5.0，7.5，10.0及20.0 min时从各组分别取10只小鼠(雌雄各半)，安乐处死取全血，室温放置60 min后3000×g离心5 min，取血清－20℃保存；迅速摘取双肾并即刻置－80℃保存待用。取出在－80℃冰箱中的小鼠右肾，剪成2 mm小块放入电动匀浆器中，加入5倍量的磷酸缓冲液(pH 7.4)进行匀浆[21](20 s×5次，每杵间隔10 s)，20 000×g离心30 min后弃沉淀，取上清液用Folin酚法测定蛋白质浓度。血清中及肾匀浆上清液中的PAH含量参考文献[22]测定。

Tab.1 Primer sequences of mouse organic anion transporters(mOat)for reaI-time RT-PCR

1.5 肾切片摄取PAH实验[21，23]

另取 SPF级 NIH小鼠(雌雄对半)，每组10只，除未设糊精加蔗糖对照组外，分组和给药同1.3。最后1次给药后60 min处死小鼠，迅速摘取左肾，将其置于消过毒的瓷板上。用无菌手术刀片从肾门沿长轴将肾平均切成2份。每份沿长轴均等切成3条(约2 mm厚)，再将其均等切成3块。冰冷PBS涮洗后用滤纸吸干，放入12孔培养板(内有充足了氧气的PBS 1 mL，含PAH 2 mmol·L－1，每孔放1个肾的切块)，置CO2培养箱，37℃，5% CO2中温育20 min，每隔5 min震摇5 s。取出培养板后迅速加入250 μL 10%三氯醋酸溶液并震摇混匀以终止反应。上述孵育的肾组织块的匀浆操作及其所含PAH浓度的测定同1.4。PAH的摄取量以g·L－1·g－1蛋白表示(即每升匀浆液中单位蛋白质所对应的PAH)，并求出各组实际摄取量所占对照组的百分率。

1.6 用实时荧光PCR测定肾组织Oat mRNA水平

－80℃冰箱中取左肾提取总RNA，步骤严格按照RNA提取试剂盒说明书进行。用紫外分光光度法测定A260nm和A280nm，A260nm/A280nm比值在1.8～2.2之间的样本用于进行实时荧光PCR。逆转录反应用PrimeScriptTMRT试剂盒进行。用ABI 7500实时定量PCR仪进行逆转录反应，反应条件为37℃15 min，85℃31 s，1个循环。PCR反应使用SYBRⓇPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒，体系为20 μL，其中含10 μL SYBRⓇPremix Ex TaqTMⅡ，上、下游引物各0.8 μL，0.4 μL ROX Reference DyeⅡ，2 μL前述逆转录产物，用DEPC处理水补足至20 μL。每个待检基因重复做3个反应孔。PCR反应条件为:95℃预变性30 s，然后进入循环阶段，每个循环包括95℃变性15 s，56℃退火30 s，72℃延伸31 s，共40个循环。以GAPDH作为内参照，用2－△△Ct方法计算目的基因的相对表达水平。

1.7 统计学分析

血清中PAH的主要药动学参数(t1/2β，Vd，Cl和AUC0－20min)及肾组织中PAH蓄积量的药-时曲线下面积(AUC0－20min)由药动学软件(DAS2.0)算出[24]并由Bailer法[25－26]计算AUC及肾与血清AUC比值。所有定量数据均用表示。以SPSS17.0统计软件对所求得药动学参数进行单因素方差分析及最小显著性检验(LSD)。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 GRI和DRI中靛蓝和靛玉红的含量

靛蓝和靛玉红含量测定结果表明，本研究所用GRI中，每克药材含靛蓝3.03 μg，靛玉红3.92 μg；DRI中每克药材含靛蓝29.45 μg，靛玉红3.12 μg。

2.2 PAH清除实验中药动学参数的改变

由PAH标准溶液(浓度范围0.0586～30.0000 mg·L－1，10个梯度)得标准曲线(Y＝0.3937X－0.0025，R＝0.9986)，以此标准曲线换算出血清和2种肾组织匀浆液中PAH浓度(此法日内变动0.41%～9.52%，日间变动 4.65%～10.85%，重现性 90.81%～109.14%)。

小鼠体内PAH的药-时曲线符合二室模型，可用等式Cs＝Ae－at＋Be－βt来描述双指数浓度-时间曲线，其中Cs是在给PAH后时间t(min)时的血清PAH浓度(mg·L－1)。用药动学软件(DAS2.0)计算主要药动学参数消除半衰期(tβ1/2)、分布容积(Vd)、清除率(Cl)和AUC0→20min(表2)。纯水组、CMC-Na组与糊精加蔗糖组3个对照组之间所测药动学参数均无差异；与纯水对照组(或CMC-Na组)相比，GRI 2.460 g·kg－1、靛蓝0.640 mg·kg－1和靛玉红 1.5360 mg·kg－1组 t1/2β显著延长(P＜0.05)，4种供试物各剂量组Vd和Cl均显著减少 (P＜0.01)而 AUC0→20min则 均 显 著 增 加(P＜0.01)。

2.3 小鼠肾组织中PAH蓄积量的改变

静注PAH后由各采血点对应的肾组织内的PAH蓄积量所得AUC0－20min如表3所示。在纯水、CMC-Na与糊精加蔗糖3个对照组之间无显著性差异；与对照组相比，各剂量的板蓝根及其关联供试物组的AUC0－20min(即PAH蓄积量)如同丙磺舒组(标准抑制剂)一样均显著地升高(P＜0.05)。肾AUC与血清 AUC比值[25－26]各组均在 0.325～0.431之间，说明血中PAH浓度升高后肾组织中的蓄积量也同比例增加，即各组内的增加量虽不同，但各自在血液和肾组织中增加的比例是相近的，提示该过程无代谢酶及其他转运体参与。

Tab.2 Effect of granuIes of Radix Isatidis(GRI)，decoction of Radix Isatidis(DRI)，indigo and indirubin on pharmacokinetic(PK)parameters of p-aminohippuric acid(PAH)

Tab.3 AUC0－20minof PAH in bIood and kidney and kidney-to-bIood AUC ratios of mice after treatment with GRI，DRI，indigo and indirubin

2.4 肾切片摄取PAH量的改变

各组受试小鼠左全肾切片孵育20 min后所摄取的PAH的定量结果如表4所示。所有供试物各剂量组的PAH摄取量均显著低于纯水和CMC-Na对照组(P＜0.05，P＜0.01)。GRI 2.460 g·kg－1和靛玉红1.5360 mg·kg－1组所摄取的PAH与丙磺舒组类似，仅为对照组的50.8%和55.6%，说明肾近曲小管上皮细胞基底膜侧的Oat被强烈抑制。

2.5 小鼠肾组织Oat1，Oat2及Oat3 mRNA表达水平的改变

各供试物组小鼠肾组织Oat1，Oat2及Oat3 mRNA表达水平如表5所示。与相应对照组比较，4种供试物分别在 2.460 g·kg－1，6.4 g·kg－1，0.640 mg·kg－1和1.5360 mg·kg－1时 Oat1，Oat2及Oat3 mRNA表达水平均显著改变，除靛玉红组Oat2 mRNA(P＜0.05)和GRI组Oat3 mRNA(P＜0.01)表达水平被显著上调外，其他Oat mRNA表达均被显著下调(P＜0.05，P＜0.01)。

3 讨论

PAH是 OAT1，OAT2和 OAT3的共同底物[17]，丙磺舒为OAT1，OAT2和OAT3的共同抑制剂[27]。本研究以PAH为探针药、丙磺舒为阳性对照，分析对比了溶媒对照组和GRI、DRI、靛蓝和靛玉红组小鼠在PAH清除实验中的主要药动学参数(t1/2β，Vd，Cl和AUC等)和肾组织内的PAH蓄积量以及体外肾切片孵育后的PAH摄取量的差异，并以定量实时-PCR最终验证了所测供试物对受试小鼠肾组织Oat基因的调控，以此推测板蓝根及其所含靛蓝和靛玉红对人类肾主要OAT的可能影响。

有研究报道，小鼠Oat1，Oat2和Oat3与人类OAT1，OAT2和OAT3具有高度同源性[17，28－29]，并且同样分布于肾近曲小管基底膜上[13－18，30]。OAT在不同种属动物的分布有些差异，在人类肾组织主要为OAT1和OAT3，而OAT2虽在肾组织有表达，但主要分布在肝，但在小鼠肾组织不仅有Oat1和Oat3，而且还有专属性的Oat2[17]。因此，本研究一并检测了Oat2及其对应mRNA。

Tab.4 Effect of GRI，DRI，indigo and indirubin on PAH uptake by kidney sIices of mice

Tab.5 Expression of Oat1，Oat2 and Oat3 mRNA in kidney tissue of mice after treatment with GRI，DRI，indigo and indirubin

GRI临床用量为5～10 g一次，一日3～4次(本研究取每人5 g)，而板蓝根饮片临床用量为10～15 g[1](本研究取每人13 g)。本研究依据黄继汉等[31]的建议将小鼠等效于临床剂量，设为临床用量的8倍，而将高剂量设为临床用量的32倍，为此本研究剂量分别为GRI 0.615及2.460 g·kg－1(生药量)和DRI 1.6及6.4 g·kg－1(生药量)。

据报道，靛蓝和靛玉红具有抗菌作用[1－2]，故长期以来靛蓝和靛玉红一直被作为GRI、板蓝根及大青叶等药材的活性成分及质控和工艺考察的指标[3－4]。然而板蓝根药材中，靛蓝和靛玉红的含量跨度范围 很 大[2－9，19]，分 别 为 0.000005% ～0.09574%(相差19 148倍)和0.0%～0.08639% (相差 8639倍)。因本研究假设靛蓝的含量为0.0005%，靛玉红的含量为0.0012%，故在所设DRI剂量 1.6和 6.4 g·kg－1中，靛蓝含 0.008和0.032 mg·kg－1，靛玉红含0.0192和0.0768 mg·kg－1。据报道，GRI中靛蓝和靛玉红的含量＜0.001% (10 μg·g－1药材)[2－9，19]，由此推算，本研究所用GRI 0.615和2.460 g·kg－1中二者分别含 0.0062和0.0246 mg·kg－1(比本次所用剂量小1.3～62.4倍)。本研究测得本次所用DRI中靛蓝含29.45 μg·g－1(0.002945%，比本次假设含量高5.9倍)，靛玉红含3.12 μg·g－1(0.000312%，是本次假设含量的0.3倍)。GRI中靛蓝含3.03 μg·g－1(0.000303%，是本次假设含的0.6倍)，靛玉红含3.92 μg·g－1(0.000392%，是本次假设含量的0.3倍)。

虽然靛蓝和靛玉红的毒性很低(小鼠经口给药，靛蓝LD50＞32 g·kg－1，而靛玉红LD50为0.3 g·kg－1)[32]，在一定剂量范围内比较安全(靛玉红在国内外已有多年被用于抗肿瘤药物[33])。然而，本研究的多次重复实验中二者所用剂量非常小，远低于药材及制剂中的实际含量，但其对Oat的抑制作用却依然非常明显，这不得不引起我们的注意。板蓝根中另含有几十种其他成分，因其大多含量很少，来源困难，故本研究未观察它们对Oat的抑制作用。虽不能排除这些成分也可能参与抑制Oat，但从靛蓝和靛玉红在本研究中所用剂量的效应来看，板蓝根抑制Oat的作用可能主要来自靛蓝和靛玉红。因此推测，凡含有靛蓝和靛玉红的草药中可能均会影响肾Oat的功能。

GRI中除其水提物外作为添加剂还有糊精和蔗糖[1]，文献检索中未发现此两种物质对药物代谢酶和转运体有影响，但因一些药代酶及转运体对许多化合物非常敏感，本研究在PAH清除实验中仍然增设了糊精加蔗糖对照组(二者1∶1混合物，各1.5 g·kg－1)，以验证它们是否参与GRI抑制Oat的作用。本研究结果表明，糊精加蔗糖组小鼠的各项PK参数与纯水对照组或CMC-Na对照组比较，均无统计学差异。因而在肾切片摄取PAH实验和PCR实验中均省略了该对照组。

为了选择合适的采血时间范围，在预实验中分别给受试小鼠口服纯水和丙磺舒1次，90 min后尾静脉注入PAH 30 mg·kg－1，在注射PAH后1.0，2.5，5.0，7.5，10，12.5，15，20，25，30，40，50，60 min时分别采血并定量血中PAH含量，作出完整的PAH药-时曲线图。结果显示，其AUC在丙磺舒组明显大于纯水组，说明丙磺舒抑制了肾Oat对PAH的摄取和排泄，使血中的PAH残留量增加。另外，血中PAH浓度在30 min前各采血点两组间均有明显差异，因此，在正式实验中本研究在0～20 min区间设计了6个采血点。

通常认为AUC是最重要的PK参数，因此本研究也参照文献[34－35]对不同剂量各供试物组的血清AUC及肾组织AUC予以了关注。与对照组相比，各剂量供试物组血清 AUC全部增加(增加39%～59%)，然而各组间肾组织AUC对血清AUC比值均无显著差异。这说明PAH几乎不受除OAT以外的其他转运体或代谢酶的影响。当血中浓度升高时，肾组织中浓度也以相似的比例升高，而AUC比值(肾组织/血清)在各组间几乎相同，均在0.31～0.43范围变化。

本研究在正式肾切片摄取PAH实验前，对孵育液中最佳PAH浓度和最佳孵育时间等进行了考察。结果表明，PAH浓度在1.0～2.0 mmol·L－1范围时较合适，而孵育时间则以20 min为宜，时间过长反而呈下降趋势(数据略)。当肾小管表皮细胞的基底膜上的OAT被抑制时探针药PAH被摄入肾小管的量就减少[13]。因此，PAH清除实验是通过体内方法测定血中PAH药动参数及肾组织(匀浆)中PAH蓄积量来反映肾小管上OAT的功能，而肾切片摄取PAH实验则是用体外方法验证OAT的功能是否受阻。

实时荧光PCR实验结果表明，与相应对照组比较，GRI、DRI、靛蓝和靛玉红4种供试物均显著改变了肾组织Oat1，Oat2及Oat3 mRNA表达水平，除靛玉红组Oat2 mRNA和GRI组Oat3 mRNA表达水平被显著上调外，其他Oat mRNA表达均被显著下调。由此进一步表明，GRI、DRI、靛蓝和靛玉红可明显抑制小鼠Oat的功能。至于靛玉红上调Oat2 mRNA表达、GRI上调Oat3 mRNA表达，可能是Oat2和Oat3 mRNA表达与对应转运体蛋白表达水平不一致所致[36－39]。

本研究结果表明，小鼠给予GRI、DRI、靛蓝和靛玉红4种供试物后，在PAH清除实验中，t1/2β延长25%～89%，Vd减少34%～54%，Cl下降25%～42%，AUC0→20min增加39%～59%，肾组织中 PAH蓄积量大幅增加；体外孵育的肾切片对PAH的摄取量明显减少，Oat1，Oat2及Oat3 mRNA表达明显改变，即上述作用与丙磺舒相似。由此提示，板蓝根及其所含靛蓝、靛玉红可强烈抑制Oat1，Oat2和Oat3的功能。

对于板蓝根及其主要成分抑制OAT1，OAT2和OAT3各亚型的程度，它们在基因水平上对小鼠肾Oat所产生的抑制作用是否与某些核受体如组成型雄烷受体和孕烷X受体等或微小RNA等有关，以及对有机阳离子转运体的影响及其动力学参数尚待研究。

致谢:本校2009级毕业实习生陈怡兰、曹小会、赵亚雷、王雪荣、张敏、王艺璇、曾思娜、李永斌、李丽君等参加了部分实验工作,在此表示谢意。

[1] ChinesePharmacopoeiaCommission.Chinese Pharmacopoeia，Vol 1(中华人民共和国药典一部)[S].Beijing，Chinese Medical Science and Technology Press，2010.800-801.

[2] Fan LF，Zhang LT，Yuan ZF，Xu HJ，He W. HPLC determination contents of indigo and indirubin in Radix Isatidis[J].Chin J Pharm Anal(药物分析杂志)，2008，28(4):540-543.

[3] Sun LX，Tang H，Yin P，Ning LL，Bi KS.Determination of the content of indigo and indirubin in the indigowoad root and leaves by RP-HPLC[J].J Shenyang Pharm Univ(沈阳药科大学学报)，2000，17(3):191-193.

[4] Jiang J，Sun M，Yang BL，Wang B，Jiang GB. Study on testing model for indigotin and indirubin contents of compound indigowoad root granule using NIRS[J].J Anhui Agri Sci(安徽农业科学)， 2009，37(32):15676-15678.

[5] Xiao SS，Jin Y，Sun YQ.Recent progress in the studies of chemical constituents，pharmacological effects and quality control methods on the roots of Isatis indigotica[J].J Shenyang Pharm Univ(沈阳药科大学学报)，2003，20(6):455-459.

[6] Zhang GQ.Study on efficacy and adverse effect of Banlangen[J].Sun Yatsen Univ Forum(中山大学学报论丛)，2007，27(18):293-296.

[7] Zhou LL.Talking about the adverse reactions and the rational use of medicine[J].Chin J Curr Tradit West Med(中华现代中西医杂志)，2005，12(3): 1114.

[8] Huang JT.Review on chemical components and pharmacological effect of Banlangen[J].Chin J Mod Drug Appl(中国现代药物应用)，2009，3 (15):197-198.

[9] Li YF，Zhang LH，Zhao JR.Adverse effects of Banlangen[J].Chin J Clin Ration Drug Use(临床合理用药)，2011，4(11A):92-93.

[10] Hediger MA，Johnson RJ，Miyazaki H，Endou H. Molecular physiology of urate transport[J].Physiology(Bethesda)，2005，20:125-133.

[11] Sekine T，Miyazaki H，Endou H.Molecular physiology of renal organic anion transporters[J].Am J Physiol Renal Physiol，2006，290(2):F251-F261.

[12] Duan P，You G.Novobiocin is a potent inhibitor for human organic anion transporters[J].Drug Metab Dispos，2009，37(6):1203-1210.

[13] Burckhardt G，Burckhardt BC.In vitro and in vivo evidence of the importance of organic anion transporters(OATs)in drug therapy[J].Handb Exp Pharmacol，2011，(201):29-104.

[14] Bakhiya N，Arlt VM，Bahn A，Burckhardt G，Phillips DH，Glatt H.Molecular evidence for an involvement of organic anion transporters(OATs)in aristolochic acid nephropathy[J].Toxicology，2009，264(1-2):74-79.

[15] Babu E，Takeda M，Nishida R，Noshiro-Kofuji R，Yoshida M，Ueda S，et al.Interactions of human organic anion transporters with aristolochic acids [J].J Pharmacol Sci，2010，113(2):192-196.

[16] Hagos Y，Wolff NA.Assessment of the role of renal organic anion transporters in drug-induced nephrotoxicity[J].Toxins(Basel)，2010，2(8): 2055-2082.

[17] Klaassen CD， Aleksunes LM.Xenobiotic， bile acid，and cholesterol transporters:function and regulation[J].Pharmacol Rev，2010，62(1): 1-96.

[18] Sweet DH，Miller DS，Pritchard JB，Fujiwara Y，Beier DR，Nigam SK.Impaired organic anion transport in kidney and choroid plexus of organic anion transporter 3(Oat3(Slc22a8))knockout mice[J].J Biol Chem，2002，277(30):26934-26943.

[19] Ma L，Sun Q，Li Y，Xiao XH.HPLC determination of indigo and indirubin in Radix Isatidis and Banlangen granules[J].Chin J Pharm Anal(药物分析杂志)，2010，30(9):1642-1645.

[20] Sweeney DE，Vallon V，Rieg T，Wu W，Gallegos TF，Nigam SK.Functional maturation of drug transporters in the developing，neonatal，and postnatal kidney[J].Mol Pharmacol，2011，80(1): 147-154.

[21] Kiguchi M，Sudo J.Comparative study of colorimetric method using diazotization reaction and high-performance liquid chromatographic method in determination of para-aminohippuric acid[J].J Toxicol Sci，1987，12(3):301-307.

[22] Nakakariya M，Shima Y，Shirasaka Y，Mitsuoka K，Nakanishi T，Tamai I.Organic anion transporter OAT1 is involved in renal handling of citrulline[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2009，297(1):F71-F79.

[23] Cristofori P，Zanetti E，Fregona D，Piaia A，Trevisan A.Renal proximal tubule segment-specific nephrotoxicity:an overview on biomarkers and histopathology[J].Toxicol Pathol，2007，35(2):270-275.

[24] Chen ZY，Zheng QS，Sun RY.Functions of the DAS software for pharmacological calculation[J]. Chin J Clin Pharmacol Ther(中国临床药理学与治疗学)，2002，7(6):562-564.

[25] Bailer AJ.Testing for the equality of area under the curves when using destructive measurement techniques[J].J Pharmacokinet Biopharm，1988，16 (3):303-309.

[26] Chew WK，Segarra I，Ambu S，Mak JW.Significant reduction of brain cysts caused by Toxoplasma gondii after treatment with spiramycin coadministered with metronidazole in a mouse model of chronictoxoplasmosis[J].Antimicrob Agents Chemother，2012，56(4):1762-1768.

[27] Drug Development and Drug Interactions:Table of Substrates，Inhibitorsand Inducers[EB/OL]. (2006-05-01)[2014-11-06]http://www.fda.gov/ Drugs/DevelopmentApprovalProcess/Development-Resources/DrugInteractionsLabeling/ucm093664.htm

[28] Burckhardt G，Wolff NA.Structure of renal organic anion and cation transporters[J].Am J Physiol Renal Physiol，2000，278(6):F853-F866.

[29] Ohtsuki S，Kikkawa T，Mori S，Hori S，Takanaga H，Otagiri M，et al.Mouse reduced in osteosclerosis transporter functions as an organic anion transporter 3 and is localized at abluminal membrane of blood-brain barrier[J].J Pharmacol Exp Ther，2004，309(3):1273-1281.

[30] Buist SC，Klaassen CD.Rat and mouse differences in gender-predominant expression of organic anion transporter(Oat1-3；Slc22a6-8)mRNA levels[J].Drug Metab Dispos，2004，32(6):620-625.

[31] Huang JH，Huang XH，Chen ZY，Zheng QS，Sun RY.Dose conversion among different animals and healthy volunteers in pharmacological study[J]. Chin J Clin Pharmacol Ther(中国临床药理学与治疗学)，2004，9(9):1069-1072.

[32] MaterialSafetyData Sheet(MSDS)[EB/OL]. (2002-08-16)[2014-1-30]http://www.ilpi.com/msds/

[33] Buolamwini JK.Cell cycle molecular targets in novel anticancer drug discovery[J].Curr Pharm Des，2000，6(4):379-392.

[34] US-FDA.Center for Drug Evaluation and Research (CDER)，Guidance for Industry，Drug Interaction Studies－Study Design，Data Analysis，Implications for Dosing，and Labeling Recommendations[EB/ OL].(2012-05-01)[2004-01-30]http://www.fda. gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatory-Information/Guidances/default.htm

[35] US-FDA.Drug Development and Drug Interactions: Possible Models for Decision Making[EB/OL]. (2006-03-24)[2004-01-30]http://www.fda.gov/ Drugs/DevelopmentApprovalProcess/DevelopmentResources/DrugInteractionsLabeling/ucm093583. htm

[36] Villar SR，Brandoni A，Anzai N，Endou H，Torres AM.Altered expression of rat renal cortical OAT1 and OAT3 in response to bilateral ureteral obstruction[J].Kidney Int，2005，68(6):2704-2713.

[37] Kojima R，Sekine T，Kawachi M，Cha SH，Suzuki Y，Endou H.Immunolocalization of multispecific organicanion transporters， OAT1， OAT2， and OAT3，in rat kidney[J].J Am Soc Nephrol，2002，13(4):848-857.

[38] Kimura H，Takeda M，Narikawa S，Enomoto A，Ichida K，Endou H.Human organic anion transporters and human organic cation transporters mediate renal transport of prostaglandins[J].J Pharmacol Exp Ther，2002，301(1):293-298.

[39] Bahn A， Ljubojevic M， Lorenz H， Schultz C，Ghebremedhin E，Ugele B，et al.Murine renal organic anion transporters mOAT1 and mOAT3 facilitate the transport of neuroactive tryptophan metabolites[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，289 (5):C1075-C1084.

Inhibition of Radix Isatidis and its constituents indigo and indirubin on major organic anion transporters Oat1，Oat2 and Oat3 in mouse kidneys

QI Jin-feng1，SUN Chen1，WANG Yong-hui2，YU Wen-hao1，HAN Jian1，LIN Mei3，ZHANG Na1
(1.Department of Pharmacology，College of Traditional Chinese Materia Medica，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China；2.Pharmacy Department，Zhumadian First People′s Hospital，Zhumadian 463000，China；3.Pharmacy Department，Nanhai Hospital of Traditional Chinese Medicine，Foushan 528200，China)

OBJECTIVE To investigate the inhibition of Radix Isatidis and its major constituents indigo and indirubin on three principal subtypes of organic anion transporters(OATs)，Oat1，Oat2 and Oat3 in vivo in mice.METHODS Granules of Radix Isatidis(GRI)0.615 and 2.46 g·kg－1，decoction of Radix Isatidis(DRI)1.6 and 6.4 g·kg－1，indigo 0.008 and 0.64 mg·kg－1and indirubin 0.0192 and 1.536 mg·kg－1were ig given to the NIH mice(60 mice per group)，twice a day，for 5 d while four control groups were set up，including vehicle of water，0.5%sodium carboxymethyl cellulose(CMC)，positive control probenecid(0.05 g·kg－1)and additives of sucrose plus dextrin(1.5 g·kg－1each)groups.After the last dosing of the test samples，para-aminohippuric acid(PAH)clearance test was conducted.All the mice were iv given PAH 0.03 g·kg－1and 1，2.5，5，7.5，10 and 20 min later before 10 mice per group were euthanized to collect whole blood and the kidneys were quickly removed.Each right kidney was homogenized to analyze the PAH accumulations and each left kidney to extract total mRNA for analysis of Oat1，Oat2 and Oat3 gene expressions using quantitative real-time PCR.The concentrations of PAH in sera and in kidney homogenates were determined by the method of Kiguchi.Major pharmacokinetic parameters of PAH in sera were calculated by pharmacokinetic software(DAS2.0).PAH uptake test for kidney slices was performed on another group of NIH mice according to the method of Nakakariya.RESULTS There was no significant difference between water control group and 0.5%CMC group in all the examined items.Compared with the vehicle control groups(water and 0.5%CMC group)，elimination half time (t1/2β)of PAH in GRI 2.46 g·kg－1，indigo 0.64 mg·kg－1and indirubin 1.536 mg·kg－1groups was significantly prolonged(P＜0.05)，the total clearance(Cl)and volume of distribution(Vd)were obviously reduced(P＜0.01)and the area under the curve(AUC0－20min)of PAH in all the tested groups was significantly increased(P＜0.01).AUC0－20minobtained from renal PAH accumulations within the checked time was significantly higher(P＜0.05，P＜0.01)than in the vehicle control group.But there was in no significant difference between all the study groups in kidney-to-plasma AUC ratios.PAH uptake results by kidney slices were significantly lower(P＜0.05，P＜0.01)than in vehicle control group in every two dosages of all the four samples tested.Compared with vehicle control group，the mRNA expressions of Oat1，Oat2 and Oat3 were obviously(P＜0.05，P＜0.01)and abnormally regulated in the groups of GRI 2.46 g·kg－1，DRI 6.4 g·kg－1，indigo 0.64 mg·kg－1and indirubin 1.536 mg·kg－1.CONCLUSION The renal Oat1，Oat2 and Oat3 of mice are significantly inhibited by GRI，DRI，indigo and indirubin.The inhibitory function of Radix Isatidis probably stems from indigo and indirubin contained in it.

Radix Isatidis；indigo；indirubin；para-aminohippuric acid；organic anion transporters

QI Jin-feng，E-mail:qijinfeng2005＠aliyun.com，Tel:13711301907

R285.1

:A

:1000-3002(2014)06-0878-09

10.3867/j.issn.1000-3002.2014.06.010

2014-04-21 接受日期:2014-10-26)

(本文编辑:齐春会)

奇锦峰(1956－)，男，医学博士，研究员，硕士生导师，主要从事药代动力学(药物相互作用)研究。

奇锦峰，E-mail:qijinfeng2005＠aliyun.com，Tel:13711301907