3⁃氨基苯甲酰胺减轻骨骼肌缺血再灌注损伤的实验研究

田保玲，李奇，纪莲，刘晓梅，杨向红

（1.中国医科大学附属盛京医院病理科，沈阳110004；2.沈阳医学院附属中心医院手外三科，沈阳110024）

3⁃氨基苯甲酰胺减轻骨骼肌缺血再灌注损伤的实验研究

田保玲1，李奇2，纪莲1，刘晓梅1，杨向红1

（1.中国医科大学附属盛京医院病理科，沈阳110004；2.沈阳医学院附属中心医院手外三科，沈阳110024）

目的研究3-氨基苯甲酰胺（3AB）对鼠骨骼肌缺血再灌注损伤的保护作用，以及组织中凋亡和胀亡的存在情况。方法54只SD大鼠随机分为空白对照组、缺血再灌注组、3AB组，持续缺血4 h，再灌注6、24和48 h。检测血浆乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸磷酸激酶（CPK）活性，肌肉内丙二醛（MDA）含量、总超氧化物歧化酶（SOD）活性，进行组织学、免疫组化、超微结构分析。结果3AB组在再灌注24 h和48 h时，在MDA含量下降、SOD活性升高、骨骼肌湿重与干重比值下降、组织学改变范围及免疫组化阳性范围方面，均与缺血再灌注组有明显差异。结论再灌注开始时应用3AB对于缺血再灌注损伤有明显的保护作用，主要体现在再灌注的稍后期阶段（再灌注24 h和48 h）。缺血再灌注过程中，凋亡和胀亡是并存的。

缺血再灌注损伤；3-氨基苯甲酰胺；骨骼肌

临床上各种原因所致的断肢再植十分常见，这就涉及到缺血再灌注的问题。尽可能缩短缺血时间是减少缺血再灌注损伤的根本。在缺血时间一定的条件下，如何减轻骨骼肌缺血再灌注损伤，关系到提高断肢再植成活率及减轻患肢功能障碍的问题。至今已提出了众多减轻缺血再灌注损伤的措施［1～4］，但并没有形成一个理想的方案。有学者在心肌的缺血再灌注模型研究中发现，多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-fibose polymerase，PARP）在此过程中起重要作用，而应用PARP的特异性抑制剂3-氨基苯甲酰胺（3-aminobenzamide，3AB），能减小心肌梗死面积，对心肌的缺血再灌注损伤有保护作用［5～7］。3AB对骨骼肌的缺血再灌注损伤是否有保护作用，尚未有报道。

1 材料与方法

1.1 实验分组及模型制备

健康成年SD大鼠54只，由中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供，体质量250～300 g。随机分为缺血再灌注组、3AB组、空白对照组，每组根据再灌注时间6 h、24 h和48 h，分为3个小组，共9组，每组6只大鼠。

10%水合氯醛（3 mL/100 g体质量）腹腔注射麻醉成功后，仰卧位固定四肢，消毒，分离暴露右下肢股动静脉，用无创血管夹夹闭股动静脉，造成大鼠右下肢缺血模型。肢体缺血4 h后，缺血再灌注组直接恢复血流再灌注；3AB组在彻底恢复血流灌注前15 min腹腔注射3AB（20 mg/kg）。空白对照组只手术，不经过缺血再灌注过程。各组在再灌注6 h、24 h、48 h结束时抽取心脏血液，取右下肢腓肠肌，随后处死大鼠。

1.2 血浆乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）、肌酸磷酸激酶（creatine phosphokinase，CPK）活性测定

自心脏采集的血液在室温静置10 min后，3 000 r/min离心10 min，收集上清液，用全自动生化仪（Roche Modular P800）测定血浆LDH、CPK活性。

1.3 患肢腓肠肌电镜、组织学、免疫组化检测

将右下肢腓肠肌分成4段：一段用于检测肌肉内丙二醛（malondiadehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；一段用于电镜分析骨骼肌超微结构的变化；一段用于HE染色组织学检查和免疫组化检测，免疫组化用SP法，在自动免疫组化染色机中进行，所用抗体有Porimin、Caspase-3，购自BioGenex公司；一段直接称取湿重，然后将组织置于60℃恒温箱中烤24 h至恒重，即为干重，计算出湿重与干重的比值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 血浆LDH及CPK活性

血浆CPK和LDH活性变化可作为骨骼肌细胞损伤的指征。缺血再灌注组与3AB组的血浆LDH、CPK活性变化相似，同空白对照组相比，再灌注6 h时活性均显著升高，此后回落至正常水平，见表1。

表1 3AB对骨骼肌缺血再灌注损伤的影响Tab.1 Effects of 3AB on skeletal ischemia reperfusion injury

2.2 骨骼肌湿重与干重的比值

骨骼肌湿重与干重的比值反映了肌肉组织的水肿程度，此比值越高说明肌肉水肿程度越重。同缺血再灌注组相比，再灌注48 h时，3AB组患肢腓肠肌湿重与干重的比值明显降低；再灌注6 h和24 h时，两者无明显差异。2组同空白对照组相比，再灌注24 h和48 h时，患肢腓肠肌湿重与干重的比值均明显升高，见表1。

2.3 组织MDA含量和SOD活性

MDA含量的高低反映了机体内氧自由基的水平，SOD活力的高低反映了机体清除氧自由基的能力。同缺血再灌注组相比，3AB组在再灌注6 h、24 h和48 h时SOD活性均明显升高，其中48 h时显著升高，而MDA含量在再灌注24 h时已显著下降。同空白对照组相比，缺血再灌注组在再灌注6 h、24 h和48 h时患肢SOD活性均显著降低，MDA含量均显著增高；而3AB组只在再灌注6 h、24 h时MDA含量显著升高，SOD活性无显著降低，见表1。

2.4 组织学变化

空白对照组腓肠肌细胞形态正常，无炎细胞浸润（图1A）。再灌注6 h时，缺血再灌注组及3AB组改变基本相同，患肢腓肠肌大部分区域肌细胞形态正常，只局灶区域部分细胞内可见空泡、裂隙，无或仅少量中性粒细胞浸润。再灌注24 h时，缺血再灌注组的组织学改变显著，大片区域出现细胞变性、溶解，明显的中性粒细胞浸润；再灌注48 h时，病变肌纤维与周围相对正常肌纤维对比更加显著，细胞核密度增加，同样有明显的中性粒细胞浸润（图1B）。3AB组再灌注24和48 h时变化类似缺血再灌注组，但病变范围明显局限，病变程度较轻，浸润的中性粒细胞较少（图1C）。

图1 再灌注48 h时3组患肢腓肠肌组织学改变HE×200Fig.1 Gastrocnemius muscle histological changes of the 3 groups at 48 h after reperfusion HE×200

2.5 Porimin和Caspase-3的免疫组化

Porimin和Caspase-3的阳性着色均位于胞质，呈棕黄色。空白对照组阴性。缺血再灌注组及3AB组，再灌注6 h时，二者均阴性。再灌注24和48 h时，可见阳性染色，阳性着色范围与组织学形态改变范围一致，阳性染色细胞形态上可见空泡、裂隙、溶解改变（图2）。经过比对，Porimin和Caspase-3的阳性部位重叠。

图2 再灌注48 h时3组患肢腓肠肌Caspase⁃3的免疫组化×200Fig.2 Immunohistological changes of Caspase⁃3 in the 3 groups at 48 h after reperfusion×200

2.6 超微结构变化

正常肌纤维排列整齐，肌纤维间见清楚的线粒体。损伤较轻者，肌纤维胞质内见较多的空泡，肌纤维间线粒体嵴减少、外膜模糊。损伤较重者，肌纤维部分溶解、线粒体外膜模糊，肌浆网扩张，肌细胞核膜肿胀，核内异染色质边集、凝聚明显。

3 讨论

PARP是一类存在于多数真核细胞中的蛋白质翻译后修饰酶，通过它的DNA修复功能，在维持基因组的稳定和细胞的死亡过程中都发挥着重要作用。组织缺血再灌注损伤诱发的氧化应激反应会导致大量DNA损伤，从而诱发PARP过度激活，PARP过度激活可以介导一系列反应，消耗大量的能量物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和三磷酸腺苷，最终导致细胞死亡，PARP在细胞死亡的分子机制链条中处于下游位置，是各种损伤导致细胞死亡的最终共同路径［5～7］。在肝脏、大脑、心肌的缺血再灌注模型研究中发现，应用PARP的抑制剂3AB能减轻器官的缺血再灌注损伤［5～7］。

我们的研究显示在缺血4 h后，3AB组与缺血再灌注组都存在不同程度的缺血再灌注损伤，但两者损伤程度不同。再灌注6 h时，3AB组与缺血再灌注组相比，仅SOD活性升高，其余改变近似，表明2组在再灌注早期（6 h）组织损伤的程度相似，但3AB组清除氧自由基的能力高于缺血再灌注组。再灌注24 h时，3AB组在MDA含量下降、SOD活性升高方面较缺血再灌注组有显著差异。3AB组的组织学改变范围及Porimin和Caspase-3免疫组化阳性范围均较缺血再灌注组明显局限。此时，3AB组表现出较明显的保护作用。再灌注48 h时，相比缺血再灌注组，3AB组除延续再灌注24 h的各项差异外，患肢腓肠肌的湿重与干重的比值明显下降。表明3AB组继续表现出明显的保护作用。

我们的研究结果显示，在再灌注开始时应用3AB对于缺血再灌注损伤有明显的保护作用，主要体现在再灌注稍后期（再灌注24 h、48 h）阶段，可作为骨骼肌缺血再灌注损伤的防治措施之一。缺血再灌注损伤最终对机体的影响取决于损伤肢体的恢复程度，因此3AB对骨骼肌缺血再灌注损伤的最终防护作用还需要长期随访研究。

除此以外，我们还观察到骨骼肌缺血再灌注损伤中，凋亡和胀亡的并存现象。以前认为细胞的死亡有两种主要形式：坏死和凋亡，他们是截然不同的过程和生物现象。随着对细胞死亡的研究，现在认为细胞的死亡过程包括凋亡、胀亡、自噬性细胞死亡等模式，而坏死代表了细胞死亡的最后结局，而且凋亡和胀亡有不同的但重叠的调节路径［8，9］。在本研究的骨骼肌缺血再灌注模型中，可见胀亡的形态改变：细胞肿胀，内可见空泡、裂隙，甚至细胞溶解的改变，电镜下可见线粒体外膜模糊、破损，肌浆网扩张，肌细胞核形不规则，核膜肿胀。还可见凋亡的形态改变：核密度增加，内异染色质边集、凝聚。除形态改变外，在介导细胞胀亡中起重要作用的膜特异性受体Porimin，在凋亡中发挥核心作用但在胀亡细胞中阴性表达的Caspase-3，二者免疫组化的阳性表达也支持缺血再灌注损伤中存在凋亡和胀亡现象。而且Porimin和Caspase-3的阳性表达部位是一致的，可以推测骨骼肌缺血再灌注过程中凋亡和胀亡是并存的。

3AB组同缺血再灌注组相比，组织学改变范围、Porimin和Caspase-3的阳性范围明显局限，病变程度轻，表明3AB组的细胞凋亡和胀亡数量较缺血再灌注组减少。可以推测3AB组在缺血再灌注损伤的后期恢复中，细胞死亡的数量较缺血再灌注减少，损伤肢体的功能恢复较好，这亦需要对3AB在骨骼肌缺血再灌注损伤中的防护作用进行长期随访研究。

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（编辑 陈姜）

3-aminobenzamide Attenuates Ischemia Reperfusion Injury ofSkeletalMuscle

TIAN Bao-ling1，LIQi2，JILian1，LIUXiao-mei1，YANGXiang-hong1
（1.Department of Pathology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Hand Surgery，Affiliated Central Hospital of Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110024，China）

ObjectiveTo investigate the protection effect of 3-aminobenzamide（3AB），and the existence of apoptosis and oncosis in ischemia reperfusion injury of skeletal muscle.MethodsTotally 54 adult SD rats were randomly divided into control groups，ischemia reperfusion groups，and 3AB groups，which underwent 4 h of ischemia and different phases of reperfusion.The lactic dehydrogenase（LDH），creatine phosphokinase（CPK），superoxide dismutase（SOD）activity，malondiadehyde（MDA）content were determined.The changes of histology，immunohistology，and ultramicrostructure were observed.ResultsCompared with ischemia reperfusion groups，3AB groups showed obvious differences in MDA content，SOD activity，wet-to-dry weight ratio，histological and immunohistological changes.Conclusion3-aminobenzamide has protected effects on ischemia reperfusion ofskeletalmuscle.Apoptosisand oncosis coexistduring the ischemia reperfusion injury.

ischemia reperfusion injury；3-aminobenzamide；skeletal muscle

R364.1

A

0258-4646（2014）10-0906-04

辽宁省教育厅高校科研计划（L2010574）

田保玲（1973-），女，讲师，博士. E-mail：tianbaoling7@163.com

2014-07-21

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