类风湿关节炎患者血清骨形态发生蛋白7的水平及临床意义

方芳，袁红霞，丁爽，段宏梅，吴春玲，刘海娜，肖卫国

（1.中国医科大学附属第一医院风湿免疫科，沈阳110001；2.辽宁医学院护理学院，辽宁锦州121001）

类风湿关节炎患者血清骨形态发生蛋白7的水平及临床意义

方芳1，袁红霞2，丁爽1，段宏梅1，吴春玲1，刘海娜1，肖卫国1

（1.中国医科大学附属第一医院风湿免疫科，沈阳110001；2.辽宁医学院护理学院，辽宁锦州121001）

目的探讨类风湿关节炎（RA）患者血清中骨形态发生蛋白（BMP）7的水平与临床指标的关系及临床意义。方法采用酶联免疫吸附法测定46例RA患者、22例骨关节炎（OA）患者、20名健康志愿者血清BMP-7的浓度及血清基质金属蛋白酶（MMP）-3的水平，并检测RA患者血沉（ESR）、类风湿因子（RF）等临床指标，计算DAS28评分，比较RA、OA、健康对照组之间BMP-7、MMP-3的差异，并分析BMP-7与MMP-3及其他临床指标的关系；同时比较RA患者高疾病活动组与非高疾病活动组间BMP-7、MMP-3的差异。结果RA患者血清BMP-7平均2 440（1 445～3 808）pg/mL，高于OA患者及健康对照者［（1 560±1 462）pg/mL，（1 508±1 176）pg/mL］，差异有统计学意义（P＜0.001，P＜0.05）；RA患者血清MMP-3水平［（67.02±22.60）ng/mL］高于OA患者及健康对照者［（46.50±21.72）ng/mL，（23.70±17.61）ng/mL］，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.05）。RA患者高疾病活动组血清BMP-7水平与非高疾病活动组无统计学差异（P＞0.05），MMP-3水平高于非高疾病活动组（P＜0.05）。RA患者血清BMP-7与血清MMP-3、ESR、CRP、白细胞、纤维蛋白原水平呈正相关（r=0.307 3，P=0.037 8；r=0.332，P=0.024 3；r=0.461 8，P=0.001 2；r=0.333 5，P=0.023 5；r=0.360 1，P=0.015 1），与血清白蛋白、免疫球蛋白IgA负相关（r=-0.336 5，P=0.022 2；r=-0.292 3，P= 0.048 7），与病程、肿胀关节数、压痛关节数、VAS评分、血红蛋白、血小板、血钙离子、免疫球蛋白IgG、免疫球蛋白IgM、补体C3、补体C4不相关。结论BMP-7可能与RA关节炎症过程有关，血清BMP-7水平有可能作为评价RA疾病活动的指标。

类风湿关节炎；骨形态发生蛋白7；基质金属蛋白酶

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种主要累及关节的慢性炎性自身免疫性疾病。滑膜炎是RA关节病变的基本病理改变。随着病程进展，滑膜组织增厚伴有新的血管生成，形成血管翳，除了合成正常细胞外基质成分，同时还合成大量基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、基质金属蛋白酶抑制物、前列腺素和细胞因子，对关节软骨、软骨下骨及周围的软组织结构造成侵蚀和损坏，从而影响关节的功能，最终可致残。在关节软骨和骨受侵蚀和损坏的过程中，由滑膜细胞和血管翳产生的生长因子和细胞因子起重要的调控作用。这些细胞因子本身即是产生细胞因子强力的刺激因子，在互相作用、互相调节的过程中形成复杂的细胞因子网络，在RA滑膜病变中起核心作用。目前认为，在细胞因子网络中，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）α是关键的细胞因子，也已有其拮抗剂上市应用，但是其高昂的费用对多数RA患者来说并不能实现长期用药，并且其治疗仅能达到病情缓解而不是根治。所以，对RA病因特别是细胞因子网络中细胞因子作用的研究，有助于揭示RA的发病机制并为治疗提供线索和依据。

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）属于转化生长因子（transforming growth factor，TGF）β超家族［1］，对多种组织的发育、自稳和修复都具有重要的作用。BMP-7又称成骨蛋白1（osteogenic protein-1，OP-1），是BMPs家族的重要成员。BMP-7成骨能力较强，在维持关节软骨基质完整性和促进修护过程中起重要作用。BMP-7基因和蛋白在构成关节的结缔组织中均有表达，包括软骨、半月板、滑膜、韧带和肌腱［2］。近年关于BMP-7在胶原诱导的关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）模型及人滑膜细胞中的研究提示其参与了RA的发病［3～5］。

本研究采用酶联免疫吸附法测定RA患者、骨关节炎（osteoarthritis，OA）患者及健康对照者血清BMP-7的浓度及血清MMP-3的水平，并收集RA患者血沉（erythrocyte sedimentation rate，，ESR）、类风湿因子（rheumatoid factor，RF）等临床指标，计算DAS28（disease activity score in 28 joints）评分，比较RA、OA、健康对照组之间BMP-7、MMP-3的差异，并分析BMP-7与MMP-3及其他临床指标的关系，同时比较RA患者高疾病活动组与非高疾病活动组间BMP-7、MMP-3的差异，探讨RA患者血清BMP-7水平的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病例选择：选择2013年5月至10月于中国医科大学附属第一医院风湿免疫科住院治疗的RA患者46例，诊断符合1987年美国风湿病学会（American College of Rheumatology，ACR）修订的RA分类标准或2010年欧洲风湿病联盟（the European League Against Rheumatiosm，EULAR）。其中，男5例，女41例，平均年龄57.5岁（22～77岁），平均病程91个月（1.5～360个月）。并选择同期于门诊就诊或病房住院的OA患者22例，诊断符合1995年ACR修订的膝关节OA分类标准，其中，男3例，女19例，平均年龄56.8岁（29～76岁），平均病程57个月（5～240个月）。健康对照者选自健康体检者，其中，男2例，女18例，平均年龄52.5岁（31～74岁）。所有入选病例均除外合并其它风湿性疾病、感染、肿瘤、心脑血管疾病等。健康对照者既往均无RA及其他自身免疫性疾病病史。各组间性别、年龄无差异。所有标本取样均征得参与者本人同意并签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂及仪器设备：BMP-7 ELISA试剂盒及MMP-3 ELISA试剂盒（Cloud-Clone公司，美国），离心机（Sigma公司，德国），电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂，HH-B11），多功能酶标仪（TECAN，infinite M200PRO，奥地利）。

1.2 方法

1.2.1 标本采集：空腹抽取静脉血3 mL，置于含血清分离胶的抗凝管中，3 000 r/min离心20 min，取离心后上清于EP管中，做好标记，-80℃储存待用。

1.2.2 临床资料收集：收集RA患者采血同期血沉（erythrocyte sedimentation rate，ESR），类风湿因子（rheumatoid factor，RF），C反应蛋白（C-reactive protein，CRP），抗环瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗体，血白细胞（white blood cell，WBC），血红蛋白（hemoglobin，HGB），血小板（platelet，PLT），血钙离子，血清白蛋白，纤维蛋白原（fibrinogen，FIB），免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，补体C3、C4，并计数肿胀关节数、压痛关节数、患者VAS疼痛评分，应用DAS28评分器计算疾病活动指数DAS28评分。

1.2.3 实验分组：根据DAS28评分，将RA患者分为高疾病活动组（DAS28＞5.1）及非高疾病活动组（DAS28≤5.1）。

1.2.4 采用双抗体酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒检测血清BMP-7、MMP-3水平：按照试剂盒操作说明进行操作，血清标本稀释10倍，用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度（OD值）。

1.3 统计学分析

应用SPSS19.0及Graphpad Prism5.0软件进行统计学分析及作图，计量资料用或M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-Whitney检验，相关分析采用Spearman相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清BMP-7与MMP-3水平测定（图1、2）

RA患者血清BMP-7水平2 440 pg/mL（1 445～3 808 pg/mL），高于OA患者血清及健康对照者［（1 560±1 462）pg/mL，（1 508±1 176）pg/mL）］，差异有统计学意义（P＜0.001，P＜0.05）；RA患者血清MMP-3水平（67.02±22.60）ng/mL，高于OA患者及健康对照者［（46.50±21.72）ng/mL，（23.70±17.61）ng/ mL］，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.05）。

图1 血清BMP-7水平Fig.1 Serum level of BMP-7

图2 血清MMP-3水平Fig.2 Serum level of MMP-3

2.2 按疾病活动度分组比较（图3）

RA患者高疾病活动组血清BMP-7水平［（3 542±3 390）pg/mL］高于非高疾病活动组［（2 685±1 671）pg/mL］，差异无统计学意义（P＞0.05），高疾病活动组MMP-3水平［（68.10±22.53）ng/mL］高于非高疾病活动组［（63.57±23.56）ng/mL］，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图3 RA患者高疾病活动组与非高疾病活动组血清MMP-3水平Fig.3 Serum level of MMP-3 in RA patients of high disease activity group and non high disease activity group

2.3 与临床指标的相关性分析

RA患者血清BMP-7与血清MMP-3、ESR、CRP、WBC、FIB呈正相关（r=0.307 3，P=0.037 8；r= 0.332，P=0.024 3；r=0.461 8，P=0.001 2；r=0.333 5，P=0.023 5；r=0.360 1，P=0.015 1），与血清白蛋白、免疫球蛋白IgA呈负相关（r=-0.336 5，P=0.022 2；r=-0.292 3，P=0.048 7），与病程、肿胀关节数、压痛关节数、VAS评分、DAS28评分、HGB、PLT、血钙离子、免疫球蛋白IgG、IgM、补体C3、C4不相关（r未列出，P值均＞0.05）。

3 讨论

RA患者体内存在促炎和抗炎细胞因子失衡，已有大量的实验研究证实TNF-α、IL-6、IL-17、TGF-β等是RA发病重要的促炎因子。针对TNF-α、IL-6已有生物制剂英夫利息单抗、托珠单抗等上市应用，但仍有一部分患者对现有生物制剂治疗应答较差，治疗失败。因此，对影响RA发病的其他细胞因子的研究也一直在进行，研究者一直试图寻找新的抗细胞因子的RA靶向治疗药物。

1965年Urist［6］发现一种能够异位诱导肌细胞成骨的未知因子，后将其命名为BMPs。其后在体研究同样显示BMPs具有异位成骨的功能［7］。BMPs在细胞内以无活性的前体形式存在，其前体形式在分泌到细胞外后形成二聚体，可以为同聚体，也可为异聚体。分泌到细胞外的BMPs通过自分泌、旁分泌、内分泌形式发挥作用。BMP-7是BMPs的重要成员，除具有较强的成骨能力外，还具有多种生物学功能［2，8，9］，在胚胎发育的全程均有重要作用，BMP-7基因表达异常还可导致肾及眼的发育异常。在RA中，BMP-7通过Smad通路促进关节修复，但其表达增多可能对关节炎症有促进作用。目前关于BMP-7与RA的研究较少，尚缺乏其参与关节炎症过程的机制研究。

MMPs是一类参与人体生理性基质降解的内肽酶，除了参与胚胎发育，组织修复重塑，也参与一些病理过程，如关节炎。所有的MMPs以无活性的酶原形式分泌，多数分泌型MMPs通过细胞外的蛋白激酶裂解活化，对纤维连接蛋白，层黏连蛋白，Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ和Ⅹ型胶原蛋白、蛋白聚糖等均有降解作用。其中MMP-3属于基质降解酶之一，能够激活多种MMPs。多项临床实验证实血清MMP-3水平能够反映关节滑膜炎和关节损伤的水平，可以作为检测RA关节炎的指标［10～12］。

本研究发现RA患者血清BMP-7、MMP-3水平均高于OA患者及健康对照者，在高疾病活动组，BMP-7、MMP-3升高的水平更明显，且RA患者血清BMP-7水平同血清MMP-3水平及ESR、CRP、FIB等炎性指标呈正相关，提示BMP-7可能参与了RA骨破坏的过程。RA患者中高疾病活动组的血清BMP-7水平更高，既往对OA患者血清BMPs的研究发现，血清BMP-2、BMP-4较健康对照者升高，而BMP-7则无明显差异［13］，本研究亦未发现OA患者血清BMP-7与健康对照者之间的存在差异，与既往研究结果一致。本研究在进行相关性分析时发现，血清BMP-7水平与血WBC计数正相关，与IgA水平呈负相关，但未见相关文献报道，故暂视为偶然结果；血清BMP-7与血清白蛋白呈负相关，结合既往研究，考虑与炎性因子抑制肝细胞合成白蛋白有关。DAS28是评价RA病情活动的常用指标，但本研究未证实血清BMP-7水平与其有关，可能与BMP-7与肿胀及压痛关节数无关有关。尽管如此，上述结果仍然能够提示BMP-7可能参与了RA的关节炎症过程，有可能作为评价病情活动的指标，但仍需要进一步研究BMP-7与MMP-3的关系，说明BMP-7与MMP-3升高是否有必然联系。

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（编辑 王又冬）

Expression of Serum Bone Morphogenetic Protein 7 and Its ClinicalSignificance in Patientswith Rheumatoid Arthritis

FANGFang1，YUANHong-xia2，DINGShuang1，DUANHong-mei1，WUChun-ling1，LIUHai-na1，XIAOWei-guo1
（1.Department of Rheumatology and Immunology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.College of Nursing，Liaoning Medical University，Jinzhou 121001，China）

ObjectiveTo investigate the serum level of BMP-7 in patients with rheumatoid arthritis，and evaluate its clinical significance.Meth⁃odsA total of 46 patients with rheumatoid arthritis，22 patients with OA and 20 healthy volunteers were enrolled for the study.Serum BMP-7 and MMP-3 were detected with enzyme linked immunosorbent assay kit.The relationship between BMP-7 and MMP-3 and other clinical indexes were analyzed，and the BMP-7，MMP-3 differences of high disease activity group and non high disease activity group in RA patients were compared.Re⁃sultsThe serum BMP-7 level in RA patients，with an average of 2 440（ranged from 1 445 to 3 808）pg/mL，was higher than that of OA patients and health controls（1 560±1 462 pg/mL，1 508±1 176 pg/mL）（P＜0.001，P＜0.05）.The level of serum MMP-3 in patients with RA（67.02± 22.60 ng/mL）was higher than that of OA patients and healthy controls（46.50±21.72 ng/mL，23.70±17.61 ng/mL）（P＜0.05，P＜0.05）.There was no obvious difference of serum BMP-7 level in RA patients between the high disease activity group and non high disease activity group（P＞0.05），but the MMP-3 was higher in high disease activity group（P＜0.05）.RA serum BMP-7 was positively correlated with serum MMP-3，ESR，CRP，white blood cell，fibrinogen（r=0.307 3，P=0.037 8；r=0.332，P=0.024 3；r=0.4618，P=0.001 2；r=0.333 5，P=0.023 5；r=0.360 1，P= 0.015 1），but negatively correlated with serum albumin，immunoglobulin IgA（r=-0.336 5，P=0.022 2；r=-0.292 3，P=0.048 7），and not correlated with course，swollen jointcount，tenderjointcount，VAS score，hemoglobin，platelet，calcium ion，immunoglobulin IgG，immunoglobulin IgM，complement C3，complement C4.ConclusionBMP-7 is involved in RA joint inflammatory process and its level can be used as an index for evaluating RAdisease activity.

rheumatoid arthritis；bone morphogenetic protein 7；matrix metalloproteinase

R593.22

A

0258-4646（2014）09-0814-04

辽宁省医学高峰建设工程项目（2010006）

方芳（1982-），女，讲师，硕士.

肖卫国，E-mail：XOnet5670@163.com

2014-05-09

网络出版时间：