溶藻弧菌dldh基因突变株的构建及其生物学功能研究

庞欢瑛陈立明黄郁葱简纪常鲁义善吴灶和

（1. 广东海洋大学 水产学院，湛江 524088；2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088；3.广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088；4. 仲恺农业工程学院，广州 510225）

溶藻弧菌dldh基因突变株的构建及其生物学功能研究

庞欢瑛1，2，3陈立明1，2，3黄郁葱1，2，3简纪常1，2，3鲁义善1，2，3吴灶和2，3，4

（1. 广东海洋大学 水产学院，湛江 524088；2.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，湛江 524088；3.广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室，湛江 524088；4. 仲恺农业工程学院，广州 510225）

为揭示二氢硫辛酰胺脱氢酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase，DLDH）在溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）致病中的作用，以pRE112自杀质粒为载体，应用插入失活突变法构建dldh基因插入突变株，比较分析了野生株ZJ03与缺失株ZJ03Δdldh在生长、泳动能力、酶活性、生物膜形成、致病性的表现。结果表明，dldh基因的突变，使溶藻弧菌生长的迟缓期延长、泳动能力显著减弱（P＜0.05），酶活性显著降低（P ＜0.05），生物膜生成显著减少（P ＜0.05），对石斑鱼（Epinephelus coioides）的致病性也明显减弱（P ＜0.05）。本研究为从细菌能量代谢角度研究弧菌的致病机制提供理论依据。

溶藻弧菌 dldh 缺失株 生物特性

二氢硫辛酰胺脱氢酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase，DLDH）又称硫辛酰胺脱氢酶或二氢硫辛酸脱氢酶，它广泛存在于各种生物中，主要分布在生物的线粒体或质膜中［1］。DLDH是3种a丙酮酸

脱氢酶复合体不可或缺的组成部分，它与谷光甘肽还原酶、汞还原酶［2］、硫氧还蛋白和锥虫胱甘肽还原酶（Trypanothione reductase）［3］同属黄素蛋白氧化还原酶家族［4］，在能量代谢中起重要作用。然而，近年来的研究发现DLDH不仅行使氧化还原酶的功能，在细菌感染过程中也起重要作用。在猪链球菌（Streptococcus suis）中，DLDH为膜蛋白，是介导细菌粘附的重要成分之一［5］，参与感染的发生。在鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum）中，DLDH 是毒力决定因子之一［6］。DLDH在肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）中与几种糖类的运输有关，dldh的缺失导致肺炎链球菌不能输入和利用半乳糖、绵子糖和水苏糖，而且几乎丧失感染动物的能力［7］。由此可见DLDH虽然不编码毒力因子，但在细菌感染中起重要作用。

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是一种革兰氏阴性短杆菌，广泛存在于海水中，是水生动物弧菌病的主要病原菌之一［8-10］，给水产养殖业造成巨大经济损失。此外，该菌可导致人类的腹泻、中耳炎以及败血症等多种疾病［11-12］，严重危害人类健康。

与其他病原菌一样，弧菌的致病性主要取决于其与宿主之间的相互作用。弧菌通过黏附侵袭，在宿主体内增殖，产生毒素等过程，造成宿主正常功能紊乱而引起死亡等。目前对溶藻弧菌致病机制的研究主要集中在毒力因子的研究上，但是现已证明，一些弧菌的毒力相关基因被敲除后，细菌仍然具有感染力［13］。可见，弧菌的感染是由复杂的调控机制控制的，不仅仅取决于毒力因子。本研究以溶藻弧菌强毒株ZJ03为对象，通过基因重组技术构建dldh基因插入缺失突变株，并通过与野生株的对比研究，探讨DLDH的生物学功能的改变，为从能量代谢角度研究弧菌的致病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 溶藻弧菌野生株ZJ03，由本试验室从广东省湛江港海域患病红笛鲷（Lutjanus erythopterus）鱼体中分离并保存［14］；大肠杆菌MC1061（λpir）和S17-1（λpir）自杀质粒pRE112由中国科学院水生生物研究所谢海侠老师惠赠。

1.1.2 试剂 TIANamp Bacteria DNA Kit购自北京天根生化科技有限公司。Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司。Easy Pfu DNA聚合酶、Easy PureTMQuick Gel Extraction Kit、Easy PureTMPlasmid MiniPrep Kit t购自北京全式金生物技术有限公司。所有的引物合成和序列分析均由上海生工生物技术服务有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 溶藻弧菌总DNA的提取 将溶藻弧菌ZJ03菌株涂布于TSA平板，挑选单菌落接种于TSB（2% NaCl）培养基，28℃振荡培养18 h。取1 mL菌液于离心管中，10 000 r/min离心5 min收集菌体，参照试剂盒说明书提取基因组DNA，-20℃保存备用。

1.2.2 溶藻弧菌dldh基因片段的克隆 根据GenBank上登录的溶藻弧菌dldh基因序列（登录号为AGK62253）设计1对引物：上游引物P1：CGGGGTACCTTTGGGACTCTACTGACGCTCT（下划线为Kpn I位点），下游引物P2：CGAGCTCCGCTTCTTTTTCAGTCTTACCAAC（下划线为Sac I位点），以提取的溶藻弧菌总DNA为模板进行PCR扩增，扩增包含部分NADH及FAD结合区域的片段，预计片段长度为615 bp。反应条件为：94℃预变性4 min；94℃40 s，65℃ 40 s，72℃ 60 s，共31个循环，再72℃延伸 10 min。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检验后，用DNA 胶回收试剂盒切胶回收。

1.2.3 自杀质粒PRE112的提取 使用全士金公司的Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit试剂盒提取pRE112质粒，-20℃保存。

1.2.4 酶切及产物纯化回收、连接 将回收扩增片段及提取质粒，利用限制性内切酶Kpn I和Sac I分别进行酶切。将酶切回收后的dldh缺失片段与pRE112质粒载体通过T4连接酶连接构建重组自杀质粒pRE-Δdldh，并转化入E. coli MC1061感受态细胞。

1.2.5 溶藻弧菌突变株的构建 （1）分别培养含有pRE-△dldh质粒的大肠杆菌S17-1和野生型溶藻弧菌ZJ03至OD600达到0.5。（2）分别取200 μL大肠杆菌S17-1和50 μL溶藻弧菌混匀，6 000 r/min离心5 min，彻底去上清，加入60 μL TSB 液体培养

基重悬菌体，将细菌按30 μL/spot接种于无抗性的TSA固体培养基平板上，置于28℃恒温培养箱过夜培养。（3）将TSA平板上的菌落用TSB液体培养基冲洗下来，并稀释接种于含有氯霉素（Cm终浓度为25 μg/mL）的平板上，28℃培养箱静置培养48 h。（4）挑取单菌落，以dldh片段引物P1、P2，氯霉素基因引物Cm1（GGCCCTAA TACCTGTGACGGAAGAT）、Cm2（CGGGCCCTATCACTTATTCAGGCGT）以及Cm1、P2进行PCR，反应条件为：94℃预变性4 min；94℃ 40 s，61℃ 40 s，63℃ 40s，72℃ 60 s，共31个循环，再72℃延伸 10 min，筛选插入突变株并命名为ZJ03△dldh。

1.2.6 突变株的遗传稳定性检验 将插入突变株△dldh在TSA培养基上连续传代培养40代，利用引物Cm1、Cm2和Cm1、P2，PCR检测突变株第40代的插入片段的遗传稳定性。

1.2.7 突变株与野生株生长曲线的比较 将插入突变株ZJ03△dldh与野生株ZJ03分别接种于新鲜TSB培养基，28℃过夜培养，将吸光值调至0.5（OD600），按照1∶100的比例分别接种到含有新鲜培养基的干净试管中（各18支），28℃震荡培养，每隔1 h将对应试管取出测定OD600值。以时间为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制生长曲线，试验重复3次。

1.2.8 细菌泳动检测 挑取野生株溶藻弧菌及插入突变株ZJ03△dldh的单菌落，接种于含琼脂0.3%的TSA的平板上。28℃恒温培养箱过夜培养，测定泳动圈直径，试验重复3次。

1.2.9 酶活测定 二氢硫辛酰胺脱氢酶活性测定参照文献［15］进行，具体方法如下。

（1）分别培养野生株溶藻弧菌及插入突变株△dldh至OD600为0.5，然后分别进行超声波破碎，取等量上清。（2）按照以下混合反应液，首先在试管中加入 50 mmol/L、pH7.0 的磷酸盐缓冲液 2.7 mL，于 37 ℃水浴保温 10 min，依次加入0.6 mmol/L硫辛酰胺0.1 mL、1 mmol/L NADH 0.1 mL和蛋白液0.1 mL，立即混匀，使用紫外分光光度计于 340 nm 处检测吸光值，每 5 min 读数1次，连续测定 15 min。每组试验重复3次，取平均值。二氢硫辛酰胺脱氢酶活性单位定义为：在上述反应条件下每 min 氧化1 μmol NADH所需的酶量，为一个酶活性单位（U）。试验重复3次。

1.2.10 生物膜检测 生物膜检测方法参照文献［16］。将溶藻弧菌野生株及突变株单菌落划线接种于TSA平板上，28℃恒温培养过夜。用2 mL新鲜液体TSB培养基冲洗平板，调OD600至0.5。用新鲜液体培养基将菌液以1∶20的比例稀释，然后接种到96孔板中，每孔300 μL，每菌种设6个平行。阴性对照为等量TSB液体培养基。将96孔板置于28℃恒温培养箱，静置培养48 h。无菌去离子水洗涤96孔板，每孔加300 μL，每次洗涤轻敲并倒置晾干，连续3次。每孔加150 μL甲醇，进行20 min固定，室温晾干，倒置30 min。每孔加150 μL结晶紫草酸铵染液室温染色15 min，自来水小心冲洗，直至流水澄清，室温晾干。每孔小心加入150 μL 95%的酒精，室温放置30 min，测定OD570。试验重复3次。

1.2.11 半致死率（LD50）检测 利用斜带石斑鱼考察ZJ03和ZJ03Δdldh的致病力，具体操作如下：分别接种ZJ03和Δdldh的单菌落至TSB液体培养基中28℃，200 r/min摇床培养18 h，10 000×g离心5 min，收集菌液沉淀，用pH7.2的PBS清洗沉淀3次。用PBS调OD600至0.5，菌液的浓度约为108CFU/mL。将两株细菌菌液分别用PBS稀释至0、104、105、106、107、108CFU/mL，每个浓度注射20尾，每尾鱼腹腔注射0.1 mL。记录15 d内鱼体死亡数目。观察死鱼症状，并分离死鱼体内的细菌于TSA平板上培养，PCR检测16S rDNA，测序后确认死于溶藻弧菌感染。参照改进寇氏法计算半数致死量：

lgLD50=Xk-d（∑Pi-0.5）

其中，Xk为最大对数剂量，d为相邻的两组对数剂量之差数，Pi为死亡率，i为组号。

2 结果

2.1 插入突变株的构建

利用引物P1、P2克隆dldh基因615 bp片段（图1-A），将其插入自杀质粒载体pRE112中，并通过同源重组插入溶藻弧菌基因组DNA中。利用引物Cm1、Cm2通过菌落PCR检测，可以在溶藻弧菌中扩出936 bp的氯霉素条带（图1-B），而利用Cm1、P2引物可以扩增得到长度为1 596 bp的目的条带，

说明插入突变株构建成功（图1-C）。

图1 插入突变株ZJ03△dldh构建过程

2.2 插入失活突变株遗传稳定性检测

将突变株ZJ03△dldh在TSA平板上连续传代培养40代，利用引物Cm1、Cm2和Cm1、P2检测突变株的遗传稳定性。结果表明，突变株在培养40代后仍能能扩出936 bp氯霉素条带（图2-A）和1 596 bp的插入片段（图2-B），表明插入片段可以在溶藻弧菌中稳定遗传。

图2 ZJ03△dldh的遗传稳定性分析

2.3 生长曲线的测定

通过对溶藻弧菌野生株及插入突变株△dldh在TSB培养基中的生长曲线进行比较可以看出，dldh基因的突变对溶藻弧菌的生长具有一定的影响。在迟缓期，野生株经过5 h生长后 OD600达0.5，而突变株OD600达0.5时需要7 h；在指数期，野生株经过10 h生长后 OD600达2，而突变株OD600达2时需要11 h；在稳定期，两株细菌在经过27 h生长后菌体浓度OD600均在2.7左右（图3）。从生长曲线可以看出，dldh基因的突变对细菌生长的影响主要表现在迟缓期，进入指数期后生长情况与野生株差别不大。

图3 野生株和突变株的生长曲线

2.4 细菌泳动试验

将野生溶藻弧菌ZJ03与突变株ZJ03△dldh接种于泳动平板上，其泳动结果如图4所示。野生株泳动圈为3.51±0.15，突变株为2.11±0.22，根据泳动圈直径统计分析可知dldh缺失后溶藻弧菌的泳动能力显著降低（P＜0.05）。

2.5 酶活测定

通过酶活性测定发现，突变株ZJ03△dldh单位活性为（0.091±0.005）U/mg，而野生株单位酶活

性为（0.316 ±0.008）U/mg，可见敲除株酶活性显著降低（P＜0.05），dldh的突变会影响溶藻弧菌的二氢硫辛酰胺脱氢酶活性。

图4 野生株和突变株的泳动能力

2.6 生物膜检测

通过检测发现，溶藻弧菌野生株与突变株的生物膜形成能力如图5所示。两株弧菌的生物膜形成有显著差异（P＜0.05），说明dldh的缺失会影响溶藻弧菌生物膜的形成。

图5 野生株和突变株的生物膜

2.7 LD50检测结果

将ZJ03和ZJ03Δdldh分别注射斜带石斑鱼，攻毒结果如表1所示。由试验结果可知，dldh的缺失使野生型溶藻弧菌的毒力下降约两个数量级。LD50检测结果表明，dldh影响了溶藻弧菌的致病力。毒力下降的原因可能是由于缺失株在鱼体内的能量代谢受阻，对鱼体内环境的适应性降低，增值能力减弱，从而导致感染力下降。

3 讨论

突变株的构建方法主要有一次同源重组和二次同源重组方法［17］。本试验采用一步同源重组法构建dldh插入失活突变株，将dldh内部包含部分NADH及FAD结合区域的片段克隆到自杀载体pRE112上，通过接合转移，利用同源重组将载体质粒整合于溶藻弧菌染色体上，构建插入失活突变株ZJ03Δdldh，并对其相关的生物学变化进行了比较研究。

表1 不同菌株的LD50

dldh作为能量代谢关键酶类，对生物的生长起着重要的作用。在对肺炎链球菌的研究中发现，dldh的缺失使细菌在棉子糖和水苏糖为唯一碳源的培养基上的生长显著下降［18］。在本研究中dldh基因的突变对细菌生长的影响主要表现在迟缓期的延长上，这可能是由于dldh的缺失造成初始期的能量代谢障碍所致［7］。

端生鞭毛以及众多的周生鞭毛都会影响弧菌的泳动力。而细菌的鞭毛泳动能力与黏附力和侵袭力相关［19］。在猪链球菌的研究中发现，dldh在猪链球菌黏附细胞的过程中发挥重要作用［5］。在布氏锥体虫中，研究者发现dldh基因在鞭毛区域大量分布［20］。在本研究中，ZJ03Δdldh的泳动力显著减弱，表明dldh与溶藻弧菌的泳动能力相关联。

生物膜的形成是细菌定植在宿主细胞膜表面，从而导致耐药性和免疫防御的一种多细胞行为［21］。弧菌生物膜的形成与一些特定的结构（纤毛、鞭毛和胞外多糖等）以及复杂的调控系统息息相关［22］。对叶缘焦枯病菌（Xylella fastidiosa）体外生物膜形成过程研究发现，dldh基因的表达量显著提高［23］。在本研究中，我们发现ZJ03Δdldh缺失株和野生株的生物膜形成差异显著（P＜0.05），提示dldh参与了溶藻弧菌生物膜的形成过程。

对肺炎链球菌研究表明dldh的缺失使DLDH酶活性完全丧失［18］，本研究也发现溶藻弧菌dldh的NADH及FAD结合区域突变后显著影响细菌DLDH酶活性（P＜0.05）。此外，dldh缺失的肺炎链球菌还丧失了对小鼠的感染力［18］，本研究发现溶藻弧菌dldh的缺失显著影响细菌的致病性，表现为对斜带石斑鱼的LD50下降约100倍。总之，本研究初步表

明dldh作为能量代谢基因在溶藻弧菌的致病中起一定作用，但后续仍需要补充更多的致病相关试验来阐明其致病机理。

4 结论

本研究成功构建dldh基因插入突变株ZJ03Δdldh。与野生株的对比研究表明，该突变株生长的迟缓期延长、泳动能力显著减弱（P＜0.05），酶活性显著降低（P＜0.05），生物膜生成显著减少（P＜0.05），对石斑鱼的致病性也明显减弱（P＜0.05）。

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（责任编辑 李楠）

Construction and Characterization of a Mutant of Vibrio alginolyticus ZJ03 Δdldh Strain

Pang Huanying1，2，3Chen Liming1，2，3Huang Yucong1，2，3Jian Jichang1，2，3Lu Yishan1，2，3Wu Zaohe2，3，4
（1. Fisheries College of Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088；2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals，Zhanjiang 524088；3. Key Laboratory of Diseases Controlling for Aquatic Economic Animals of Guangdong Higher Education Institutions，Zhanjiang 524088；4. Zhongkai University of Agriculture and Engineering，Guangzhou 510225）

Vibrio alginolyticus, a gram-negative bacterium has been described to be among the most common and economically important aquatic pathogen of fish and shellfish. Dihydrolipoamide dehydrogenase （DLDH）is homodimeric flavoproteins that catalyse the NAD+dependent reoxidation of dihydrolipoamide in a number of multienzyme complexes. This enzyme classically involved in energy metabolism. To identify DLDH’s role during infection, dldh gene deletion strain （ZJ03Δdldh）were constructed using the insertion mutation method. With the pRE112 suicide plasmid as the carrier, the Overlap PCR and homologous recombination technology were used to construct the mutant strains. Furthermore, the changes of the physiology and pathogenicity of ZJ03Δdldh mutant strains compared with the strain ZJ03, such as growth, swarming ability, biofilm and LD50 were investigated. The growth curve showed that the mutant grew slowly in lag phase compared to the wildtype strain, and the swarming ability, enzyme activity and biofilm formation of ZJ03Δdldh mutant strains showed significant reduced（P＜0.05）. The fish lethal test showed that the virulence of the ZJ03Δdldh mutant strains was 102times lower than the ZJ03 strain. In conclusion, the ZJ03Δdldh mutant strains were constructed successfully, and this study showed that enzymes classically involved in energy metabolism may play an important role in pathogenic mechanism of V. alginolyticus.

Vibrio alginolyticus dldh mutant Biological characteristics

2014-05-30

国家科技支撑计划（2012BAD17B02，2012 BAD17B03），广东省自然科学基金项目（S2013040014562）

庞欢瑛，女，博士，讲师，研究方向：水产经济动物病害；E-mail：phying1218@163.com

简纪常，男，博士，教授，研究方向：水产经济动物免疫学及病害控制；E-mail：jianjc@gmail.com