环境DNA研究技术及其在生态学领域的应用

徐浩 罗茜 李云 薛洋 叶勤

（西南大学动物科技学院 淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆 400716）

环境DNA研究技术及其在生态学领域的应用

徐浩 罗茜 李云 薛洋 叶勤

（西南大学动物科技学院 淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆 400716）

环境DNA（environmental DNA，eDNA）是指从环境样本中提取的所有DNA的集合，包括环境微生物以及从生物体上脱落下来的活细胞DNA和因生物死亡后细胞破碎而游离出的胞外DNA。按照宏基因组学概念，eDNA研究技术主要是指直接从环境样本中提取基因组DNA后进行测序分析的方法。较传统的研究方法，eDNA应用最大的优势在于更有效地解决了特定环境样本中宏量生物的分类问题，利于更进一步研究生态学问题，该技术耗时短、成本低，准确度高。第二代高通量测序技术的开发成功，进一步拓展了eDNA的应用范围，并开始从微生物学向动、植物学领域拓展，促进了传统生态学领域在研究方法和思想上的一场革新。对eDNA的研究技术在生物多样性分析、动物食性分析、生物量估测等生态学领域的应用进行了综述，最后对eDNA研究技术的发展趋势和前景作出展望。

环境DNA 宏基因组学 生态学 物种分类

环境DNA（environmental DNA，eDNA）是指从环境中（如土壤、水、空气等）提取的所有DNA集合，包括环境微生物以及从生物体上脱落下来的活细胞DNA和因生物死亡后细胞破碎而游离出的胞外DNA［1，2］。在自然界中eDNA量的变化是一个动态过程，不断产生的同时也不断的降解，但也有如化石一样能长久存在的古eDNA［3］。

涉及环境DNA的研究最早始于1987年，即由微生物学家从湖底沉积物中成功提取出环境微生物DNA［4］。而首先出现“eDNA”这个词应该是在

2000 年的一篇文献中［5］，该文献提出传统的培养方式培养出的细菌并不能反映所取环境中细菌群落的多样性，因为大多数的细菌在实验室条件下不可培养。研究者通过从土壤中直接提取细菌DNA基因组并利用细菌人工染色体构建环境基因组文库，经16S rRNA序列比对鉴定出了大量的微生物种类，证明了eDNA可用于研究微生物多样性以及物种鉴定。随之而来的是在生态学研究中关于eDNA应用的文献大量出现［6-8］，逐渐从微生物学拓展到了动植物学的研究领域中。

可以说eDNA应用是伴随着宏基因组学的发展而发展起来的。1998年，微生物学家Handelsman［9］首先提出了宏基因组学（Metagenomics）的概念，意指土壤微生物的全部基因组的集合。近年来，随着DNA测序技术的不断进步以及测序成本的下降极大地推动了宏基因组学的发展。现今，宏基因组学可以广义的定义为对环境中直接获得的总DNA进行分析的所有研究［10］。与传统的个体生物研究相比，宏基因组学是将环境样本所有生物以整体为研究对象，是直接从环境样本中提取基因组DNA后进行测序分析的方法［11］。而eDNA应用正是以环境生物DNA为研究对象，从整体到局部的过程，相信能在生态学各领域中得到很好的应用。

1 用于eDNA的主要研究技术

1.1 NGS技术

第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）即是目前最新的高通量测序技术。其技术的核心思想是边合成边测序，通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。现有的技术平台主要包括454 Pyrosequencer GS FLX Titanium（Roche）、Solexa GA（Illumina）、HeliScope（Helicos BioSciences）、SOLiD 4（Life/Applied Biosystems）［12］和 SMRT（Pacific Biosciences）［13］。各技术平台应用范围非常广泛，且各有所长，其中Roche 454 GS FLX测序技术最适合用于生态学中宏基因组学的研究。其测序PCR反应发生在固相的微珠上，整个PCR反应相关的酶和试剂都被油包水的液滴包裹，每个油滴系统只包含一个DNA模版进行独立的PCR扩增。扩增后，每个DNA分子可以得到富集，每个微珠代表着一个克隆集落。测序过程中，GS FLX系统会将引物上dNTP的聚合与荧光信号释放偶联起来，通过检测荧光信号达到DNA测序的目的。例如，林平等［14］通过Roche 454 GS FLX测序技术对病原菌16S rDNA的分析检测病人痰中细菌。从101例样本中发现了129个菌属，其中大量的是临床不易培养的菌属，如支原体属、嗜血杆菌属、莫拉菌属等，而临床培养出的细菌只有12种。由此可见，Roche 454 GS FLX技术能将信息量巨大的DNA集转化为具体的种属。与传统的Sanger测序相比较，NGS在很多技术上都有了突破，包括文库的构建、锚定桥接、预扩展等等，使得上百万的测序反应同时发生在一个反应里［15］，既降低了测序成本，也缩短了测序时间。尽管读取准确度以及读取片段的长度都不及Sanger测序，但这些不足可以通过测序的覆盖率和生物信息学的方法来克服，在很短的时间内完成对上百亿碱基的测序，可实现极短时间内对eDNA序列进行细致的研究。

1.2 DNA宏条形码技术

DNA条形码的主要作用是用于物种水平的鉴别，通过所得的DNA序列与标准条形码（Standard barcoding）比对，就可以知道目标生物的种类。自2002年，Tautz等［16］提出要用DNA序列作为生物分类系统的主要平台，即DNA分类学后，加拿大Guelph大学的动物学家Hebert等［17］在2003年明确提出了DNA条形码（DNA Barcoding）的概念。如今已有专门的DNA条形码数据库（International barcode of life），10年来超过10万个物种的DNA条形码数据的信息存储其中。但发展至今，传统的DNA条形码已经不能满足人们在eDNA应用中的需求。首先，与提取的组织DNA不同，eDNA通常受到不同程度的降解，甚至会降解掉DNA条形码部分的片段。其次，eDNA来源复杂，包含着所属环境的所有物种的DNA，如CYTB、16S rRNA、COI、rbcL和ITS rDNA等传统的条形码鉴定出的群落物种只能算是冰山一角。所以，Pompanon等［18］在2011年提出了一种新型DNA条形码，即DNA宏条形码（DNA metabarcoding），但是该概念目前还没有一个非常具体和权威的定义。其作用并不是用于鉴别单

一、少许的样本，而是用于多重分类单元的分类鉴定。通过合理的通用引物设计和宏DNA条形码选择可以做到对环境群落物种进行准确的分类鉴定。然而，就目前的宏条形码技术发展的水平而言，全面的鉴定环境生物还存在着非常大的挑战。例如，如何合理的选择DNA宏条形码以及通用引物的设计。对此，Pompanon等［19］在利用NGS技术检测动物食性的研究中对该难题做了详细的探讨，为更深入开发宏条形码技术提供了宝贵意见。

2 eDNA在生态学中的应用

eDNA应用的最核心的手段是能够对复杂的宏量生物环境样本DNA进行准确分类，可以说eDNA应用于分类是对传统分类学方法的一次革新，并且随着NGS技术的出现极大地降低了测序成本，使得一些研究者敢于做一些以前受技术限制和经费限制的实验，大大拓展了研究领域。下面将近年来eDNA技术在生态学中的最新应用作了回顾。

2.1 物种多样性研究

随着全球气候变化和人类活动的影响，生物多样性保护的重要性愈加突出，生物多样性已开始成为国内外研究的热点，而物种多样性作为生物多样性最基础的研究内容，准确鉴别物种就显得尤为重要。传统形态学分类方法对研究人员的专业知识和实践经验要求高，鉴定物种费时费力，准确性也不高。借助分子生物学方法来鉴定物种［20-25］，解决了形态学鉴定方法的诸多弊端，而NGS技术和eDNA应用的出现可以说是在前面方法的基础上更进一步。目前已经有少量关于eDNA应用于物种多样性研究的文献报道。例如，Blaalid等［26］对拳参属植物（Bistorta vivipara）演替过程中与其处于共生关系的外生菌根真菌多样性以及分布情况进行了研究。从60个根系中提取真菌eDNA，通用引物PCR扩增后采用Roche 454 GS FLX测序，进行数据分析后得到470个操作分类单位（OTUs），每个根系的OTUs在8-41个之间，并发现了真菌的多样性沿着顶极植被逐渐增多，其中根担子菌是优势菌株；Philip等［27］通过对丹麦港口海域的鱼类物种多样性进行评估发现，该海域中有15种鱼类。既包括重要的经济鱼类，如大西洋鳕、欧洲鳗鲡、欧鲽和大西洋鲱鱼，也有非经济鱼类，如短角大杜父鱼、尖海龙及岩梳隆头鱼，同时还发现欧洲沙丁鱼——洄游鱼类。除此之外，他们还发现了多种鸟类，包括红喉潜鸟、原鸽、疣鼻天鹅和鸬鹚。另外，与常规的9种鱼类多样性调查方式相比发现，利用eDNA除了能检测出传统方法调查到的鱼类，还能检测到用传统方法不能调查到的鱼类。以上说明eDNA技术能成功应用于物种多样性研究，有助于更加全面的了解物种资源情况。

2.2 水生动物生物量的估测

一直以来，人们对植被生物量评估方法研究比较多［28-30］，而在动物生物量评估方面的研究相对较少。其中一个重要的原因是动物好动、易躲藏且难以捕捉，为调查带来了诸多的困难。目前，科学家们仍没有找到一种合适的方法能对动物进行量的评估。但是最近出现的应用eDNA对鱼类生物量进行评估的文献报道，其方法可能对动物生物量评估的研究起到促进作用。为Teruhiko等［31］对日本的“Iba-naiko”湖中的鲤鱼进行生物量的评估。他们提出了一个假设——某物种的生物量与其释放在环境中的DNA成正比，那么通过检测该物种的eDNA浓度就可以反映出其在环境中的生物量。首先，在实验室和池塘里模拟野外环境，探索eDNA和鲤鱼数量的线性关系，证明了eDNA浓度与鱼的数量呈正相关，并建立线性方程。然后，取样于“Iba-nailo”湖中的湖水，估测鲤鱼在湖中的数量以及分布，结果发现温度越高的地方鲤鱼的数量越多。与传统捕捞方式相比，前者采样不受复杂的地质和灌木条件影响，且对环境不会造成任何破坏。通过这种方法我们可以更快的估计出物种生物量。尽管以上结论的准确度以及在未来的适用性还有待进一步验证，但其研究方法能为未来在改进生物量评估手段上提供很好的思路，相信在濒危物种的保护，以及水产养殖的科学管理等领域中应用前景广阔。

2.3 动物食性分析

食性分析最早是通过消化残留物观察法和肠道解剖法。对于通常所熟知的动物可以通过此方法在一定程度上得以了解，但对于无脊椎动物、夜行性以及生活在土壤和水下的生物通过视觉观察是很难做到的［32］。另外，显微观察具有一定的局限性，它

依赖于观察者对咀嚼后半消化食物碎片的准确判断［33-36］。为了能更准确的研究动物的食性，生态学家从分子生物学方法上着手，具体的技术包括蛋白免疫印迹［37］、近红外线光谱（Near infrared spectroscopy，NIRS）［38］、稳定同位素分析［39］、温度/变性梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis，TGGE/Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）［40］。但是每种技术都有各自的优缺点，并且适用性不一［32］，如蛋白免疫印迹技术适合于研究狭食性的捕食者［41］，对于宽食谱的动物就无能为力了；NIRS技术方便检测植食性动物消化的总氮［42］，但很难分析出食物中具体的植物种类；稳定同位素分析技术主要用于研究动物在一段较长时期内的摄食情况，而不仅仅是短期的一个摄食情况［43］；TGGE/DGGE技术主要用于研究动物的肠道、粪便等微生物群落［44，45］，在研究动物食性方面常常受到DNA条带分离技术的限制。近年来eDNA也开始被应用于动物食性的研究，其最大的优势在于能分析出动物短期的食物。如Shehzad等［46］研究了一种生活在野外的、人们对其食性了解甚少的豹猫的食性，他们从38只豹猫粪便中提取了eDNA，序列分析后发现其食物包括鱼类、两栖动物、鸟类、哺乳动物共18种生物。另外，应用eDNA技术研究食性的报道还包括海狗、企鹅、蝙蝠、熊、田鼠和蠕虫等［47-52］。可见，eDNA应用于动物食性研究潜力巨大，再结合之前的分子生物学方法取长补短，相信能在全面了解动物的食性方面取得更大进展。

2.4 重建古植物史

目前研究古植物学主要还是通过植物大化石和孢子花粉地质记录的方法。大化石包括根、茎、叶、孢子囊穗或球果等，因其肉眼可见，保存形式多样、信息较全，研究历史悠久，但无论是动物界还是植物界，能保存成化石者只是其极细小的一部分，导致地质记录严重不全［53］。与此相反，孢子花粉产量非常高［54］，并且其外壁大多由孢粉素组成，非常坚固，强酸强碱和一定程度的高温高压对其影响不大，保存能力极强［55］，但许多孢子花粉植物亲缘关系目前仍分不清楚［53］，很难对古植物群系进行准确描述，故以上两种研究方法都存在各自的局限。近年来，有大量通过分析沉积古DNA（sedaDNA）来研究古环境的文献报道［56-63］，其方法是提取保存至今的古eDNA，通过NGS测序得到eDNA基因组，分析其序列然后将古植物进行分类。例如，Mikkel等［63］通过对南格陵兰岛湖底层沉积物中古DNA的序列分析重建了格陵兰岛的古植物群系，并将eDNA方法和传统的两种方法所得出的结果相对比。从采集的38个样本中，通过Roche 454 GS-FLX测序法得到了252 902个DNA序列，数据分析出古湖中古植物包括13个科。而传统的孢子花粉和大化石地质记录分别是36个科和17个科，检测到的数量都比eDNA法多，但是后者有2个科却在前两种方法中没有记录。因此，eDNA应用对前两种方法的研究起到查漏补缺的作用。不仅如此，eDNA法与前两者的检测结果也有部分重叠，对传统的检测结果起到了验证的效果。可见，将3种方法相结合能更准确地描述古植物史。

3 展望

至今，环境生态学研究仍然面临方法有限、采样空间局限、数据处理慢及监测结果不准等问题［64］。但是近年分子生物学技术的应用开启了生态学领域的一场革命，有了NGS等技术的支撑，将极大地提升人类从生态系统中获取数据的能力，其监测模式的核心思想就是利用eDNA结合NGS技术平台快速准确的对环境生物进行分类鉴定以及生物多样性和物种分布的调查。但是，目前eDNA技术的应用在满足人们对环境信息采集的同时也面临着很大的挑战。首先，尽管人们有能力得到环境基因组序列，但是在信息处理方面的能力还显不足。虽然各种统计建模在环境应用中并不陌生，但是环境基因组因其序列来源极度复杂、采集数据的稳定性影响因子多，使得统计建模变得更加困难。其次是eDNA数据的储存问题，随着eDNA应用越来越多，将会累积大量的数据，仅仅一个环境样本就会产生千万数量级的DNA宏条形码，这就需要有更大容量的数据库来存储，就像“GenBank”一样，将有用的数据进行有效的管理和分享［65］。总之，长远来看，eDNA技术将替代一些传统技术，但是在大多数情况下它与传统方法有机结合相互补充才能够发挥更好效果，

这需要生态学家、生物信息学家和统计学家的密切协作才能实现。目前，eDNA研究尚处于初级阶段，其应用和发展前景非常广阔，这些新方法的应用将促进人们了解从分子到整个生态系统各个层次的组织结构和相互作用，整合生态学的思想也许将改变传统上人们对生态学的认识。

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（责任编辑 狄艳红）

Applications of Environmental DNA Approaches to Ecological Researches

Xu Hao Luo Xi Li Yun Xue Yang Ye Qin
（Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development（Ministry of Education），College of Animal Science and Technology，Southwest University，Chongqing 400716）

Environmental DNA（eDNA）refers to DNA that can be extracted from environmental samples, without first isolating any target organisms, which includes DNA of environmental microorganisms, alive cellular fallen off from organisms, and extracellular DNA resulting from natural death organisms and subsequent destruction of cell structure. According to metagenomics concept, eDNA technologies mainly refers to the methods of sequencing analysis with genomic DNA from environmental samples. Comparing with the traditional way, the significant advantage of eDNA technologies is more efficient in solving the classification problem of mass organisms in given environmental sample, which exert shorter time-consuming, lower cost, higher accuracy. The next generation of high-throughput sequencing technology（NGS）further expands the application fields of eDNA technologies, from microbiological field to zoological and botanic fields, and results in an innovation in research methods and ideas in traditional ecology. The present review summarized the eDNA technologies and applications aspects in analysis of biological diversity, animal diets, aquatic biomass estimation, etc. Finally, the trends and prospects regarding eDNA technologies development are presented.

Environmental DNA Metagenomics Ecology Species classification

2014-03-28

国家农业部种质资源保护项目（2013），中国长江三峡集团公司项目（0799526）

徐浩，男，硕士，研究方向：分子生态学；E-mail：haoxusw@163.com

李云，男，博士，教授，研究方向：鱼类生理生态学；E-mail：yunlicn@126.com